• search hit 9 of 14
Back to Result List

New applications of heterologous gene expression in Hansenula polymorpha for protein and metabolite production

  • The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha has been established as a highly efficient expression system. Strong promoters derived from the methanol metabolism pathway and mitotically stable high-copy integration have made this organism very effective for heterologous protein expression. To improve the processing of secretory proteins targeted by the MFα prepro sequence, variations in the amino acid composition near the processing site of Kex2p were investigated (Manuscript I). The insertion of Ala-Pro between MFα prepro sequence and protein of interest leads to an improved processing of the signal sequence in case of interleukin-6 (IL-6) and interferon-α 2a (IFNα-2a). Modeling of the transition sequences confirmed a better exposition of the Kex2p-cleavage site in dependency of Ala-Pro insertions. Analysis of the secreted proteins revealed activity of an Ala-Pro specific endoprotease. Partial removal of the N-terminal Ala-Pro dipeptide was also detected during IFNα-2a processing.The methylotrophic yeast Hansenula polymorpha has been established as a highly efficient expression system. Strong promoters derived from the methanol metabolism pathway and mitotically stable high-copy integration have made this organism very effective for heterologous protein expression. To improve the processing of secretory proteins targeted by the MFα prepro sequence, variations in the amino acid composition near the processing site of Kex2p were investigated (Manuscript I). The insertion of Ala-Pro between MFα prepro sequence and protein of interest leads to an improved processing of the signal sequence in case of interleukin-6 (IL-6) and interferon-α 2a (IFNα-2a). Modeling of the transition sequences confirmed a better exposition of the Kex2p-cleavage site in dependency of Ala-Pro insertions. Analysis of the secreted proteins revealed activity of an Ala-Pro specific endoprotease. Partial removal of the N-terminal Ala-Pro dipeptide was also detected during IFNα-2a processing. The putative protease responsible for the processing of Ala-Pro dipeptides was identified by gene deletion. Significant similarities with Saccharomyces cerevisiae Ste13p were identified. To generally improve productivity in the H. polymorpha system new fusion protein strategies were investigated (Manuscript II). The recombinantly strongly expressed cytosolic ferritin heavy chain (FTH1) was analyzed with regard to its potential as fusion partner for difficult-to-express target proteins. A fragment of the parathyroid hormone (PTH) was chosen to explore whether fusion to FTH1 enhances PTH stability. We could show that the expression level of this fusion protein was at least of the magnitude of that of FTH1 without fusion partner. The solubility of the fusion protein was increased in comparison to FTH1 alone and no degradation of PTH occurred when fused C-terminally to FTH1. Ectoine and 5-hydroxyectoine belong to the family of compatible solutes which are known to contribute to the adaptation of the cell to osmotic stress by mediation of a constant turgor. H. polymorpha was engineered to express the enzymes of the H. elongata 5-hydroxyectoine biosynthesis pathway (Manuscript III). Expression of the enzymes EctB, EctA, EctC and EctD in H. polymorpha resulted in production of 5-hydroxyectoine in gram per liter scale with almost full conversion of ectoine to 5-hydroxyectoine. We showed that 5-hydroxyectoine synthesis was influenced by feeding of methanol during cultivation. Furthermore, 5-hydroxyectoine synthesis was downregulated by the addition of methionine, lysine or threonine indicating the existence of a feedback regulated aspartate kinase in H. polymorpha.show moreshow less
  • Die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha hat sich als effizientes System zur heterologen Genexpression etabliert. Besondere Merkmale dieses Systems sind die starken Promotoren des Methanolstoffwechsels und die Fähigkeit zur mitotisch stabilen Integration einer Expressionskassette in einer hohen Kopienzahl. Am Beispiel der MF α prepro Sequenz sollte die Prozessierung sekretorisch exprimierter Proteine verbessert werden (Manuskript I). Hierfür wurden Veränderungen in der Nähe der Kex2p Erkennungssequenz durchgeführt. Durch das Einfügen von Ala-Pro zwischen MF_ prepro Sequenz und Zielprotein konnte die Prozessierung im Fall von Interleukin-6 (IL-6) und Interferon- α 2a (IFN α -2a) verbessert werden. Eine Modellierung dieses Sequenzübergangs zeigte eine verbesserte Präsentation der Kex2p-Schnittstelle. Nach Analyse des sekretierten IL-6 wurde außerdem die Aktivität einer Ala-Pro spezifischen Endoprotease festgestellt. Auch im Falle von IFN α -2a konnte eine partielle Abspaltung desDie methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha hat sich als effizientes System zur heterologen Genexpression etabliert. Besondere Merkmale dieses Systems sind die starken Promotoren des Methanolstoffwechsels und die Fähigkeit zur mitotisch stabilen Integration einer Expressionskassette in einer hohen Kopienzahl. Am Beispiel der MF α prepro Sequenz sollte die Prozessierung sekretorisch exprimierter Proteine verbessert werden (Manuskript I). Hierfür wurden Veränderungen in der Nähe der Kex2p Erkennungssequenz durchgeführt. Durch das Einfügen von Ala-Pro zwischen MF_ prepro Sequenz und Zielprotein konnte die Prozessierung im Fall von Interleukin-6 (IL-6) und Interferon- α 2a (IFN α -2a) verbessert werden. Eine Modellierung dieses Sequenzübergangs zeigte eine verbesserte Präsentation der Kex2p-Schnittstelle. Nach Analyse des sekretierten IL-6 wurde außerdem die Aktivität einer Ala-Pro spezifischen Endoprotease festgestellt. Auch im Falle von IFN α -2a konnte eine partielle Abspaltung des N-terminalen Ala-Pro-Dipeptids festgestellt werden. Ein Protease, welche mutmaßlich an der Prozessierung dieser Ala-Pro-Dipeptide beteiligt ist, wurde per Gendeletion identifiziert. Diese Protease wies signifikante Ähnlichkeiten mit der S. cerevisiae Ste13p auf. Zur allgemeinen Verbesserung der Ausbeute bei der Produktion heterologer Proteine wurden neue Fusionsprotein-Strategien untersucht (Manuskript II). Hierfür wurde das rekombinant cytosolisch stark exprimierte Protein Ferritin (schwere Kette, FTH1) im Hinblick auf das Potenzial als Fusionspartner für schwierig zu exprimieren Zielproteine analysiert. Ein Fragment des Parathormons (PTH) wurde gewählt, um zu untersuchen, ob die Fusion beider Proteine die Stabilität von PTH erhöht. Wir konnten zeigen, dass die Expression dieses Fusionsproteins mindestens in der Größenordnung des FTH1 ohne Fusionspartner war. Die Löslichkeit des Fusionsproteins wurde gegenüber FTH1 allein erhöht und es trat kein Abbau des PTH in Fusion mit FTH1 auf. Ectoin und 5-Hydroxyectoin gehören zur Familie der kompatiblen Solute, die hauptsächlich zur Anpassung der Zelle bei osmotischem Stress durch Anpassung des Turgors beitragen. Ein H. polymorpha-Stamm wurde entwickelt, welcher die Enzyme der 5-Hydroxyectoin-Biosynthese aus H. elongata exprimiert (Manuskript III). Die Expression der Enzyme EctB, EctA, EctC und EctD in H. polymorpha resultierte in der Produktion von 5-Hydroxyectoin im Gramm pro Liter Bereich. Es fand außerdem eine nahezu vollständige Umwandlung von Ectoin in 5-Hydroxyectoin statt. Wir konnten zeigen, dass die 5-Hydroxyectoin-Synthese durch Zugabe von Methanol während der Kultivierung beeinflusst wurde. Desweiteren wurde die 5-Hydroxyectoin-Synthese durch die Zugabe von Methionin, Lysin oder Threonin herunterreguliert, was andeutet, dass in H. polymorpha eine Feedback-regulierte Aspartatkinase existiert.show moreshow less

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Eva EilertORCiD
open access (DINI-Set):open_access
open access :Bronze - frei zugänglich aber ohne Lizenzhinweis, d.h. keine Weitergabe
Fachbereich/Einrichtung:Hochschule Düsseldorf / Hochschulbibliothek
Document Type:Doctoral Thesis
Year of Completion:2013
Referee:Joachim F. Ernst, Cornelis P. Hollenberg
Language of Publication:English
Publisher:Institut für Molekulare Mykologie, Institut für Mikrobiologie
Place of publication:Düsseldorf
Creating Corporation:Institut für Molekulare Mykologie, Institut für Mikrobiologie
Title Additional (German):Neue Ansätze der heterologen Genexpression in Hansenula polymorpha zur Protein- und Metabolitenproduktion
URN:urn:nbn:de:hbz:061-20130527-092604-7
Licence (German):Es gilt das deutsche Urheberrecht
Release Date:2020/12/16
Accept ✔
Diese Webseite verwendet technisch erforderliche Session-Cookies. Durch die weitere Nutzung der Webseite stimmen Sie diesem zu. Unsere Datenschutzerklärung finden Sie hier.