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Entwicklung von multidimensionalen Hochdurchsatzmethoden zur Analyse von partikelbasierten Peptidbibliotheken

  • Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Hochdurchsatzanalyse von partikelgebundenen Split-and-Mix-Peptidbibliotheken. Dabei wurde ein System entwickelt, das Partikelbibliotheken in kurzer Zeit auf ihre Bindung zu einem Zielmolekül hin untersucht und im nächsten Schritt eine direkte „Ein-Partikel“-Sequenzierung der Peptide von der festen Phase ermöglicht. Die Analyse der Bindung eines Zielmoleküls an ein selektiv bindendes Peptid wurde dabei in einem Modellsystem simuliert. Dazu wurde FITC-markiertes Neutravidin 3 mit festphasengebundenen biotinylierten und nicht-biotinylierten Peptiden inkubiert. Die Bindung von Neutravidin-FITC an die biotinylierten Peptide konnte erfolgreich mittels eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen werden, wobei diese Methode für eine Hochdurchsatzanalyse ungeeignet war. So wurde die Analyse des Fluoreszenzassays auf einen Microarrayscanner übertragen (siehe Abbildung 33). Dies gelang erfolgreich wobei die hohe Eigenfluoreszenz desZiel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Hochdurchsatzanalyse von partikelgebundenen Split-and-Mix-Peptidbibliotheken. Dabei wurde ein System entwickelt, das Partikelbibliotheken in kurzer Zeit auf ihre Bindung zu einem Zielmolekül hin untersucht und im nächsten Schritt eine direkte „Ein-Partikel“-Sequenzierung der Peptide von der festen Phase ermöglicht. Die Analyse der Bindung eines Zielmoleküls an ein selektiv bindendes Peptid wurde dabei in einem Modellsystem simuliert. Dazu wurde FITC-markiertes Neutravidin 3 mit festphasengebundenen biotinylierten und nicht-biotinylierten Peptiden inkubiert. Die Bindung von Neutravidin-FITC an die biotinylierten Peptide konnte erfolgreich mittels eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen werden, wobei diese Methode für eine Hochdurchsatzanalyse ungeeignet war. So wurde die Analyse des Fluoreszenzassays auf einen Microarrayscanner übertragen (siehe Abbildung 33). Dies gelang erfolgreich wobei die hohe Eigenfluoreszenz des Tentagel-Harzes zu falsch positiven Ergebnissen führte. Mit einem Wechsel zum längerwelligen Fluoreszenzfarbstoff ATTO-633 konnten falsch positive Ergebnisse vermieden werden. Somit wurde die zeitintensive Fluoreszenzanalyse von einem Fluoreszenzmikroskop erfolgreich auf einen Microarrayscanner übertragen, welcher in kurzer Zeit (ca. 5 min pro Objektträger) eine Vielzahl an peptidbeladenen Partikeln gleichzeitig analysieren kann.zeige mehrzeige weniger

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Metadaten
Autor*innen:Timm Schwaar
Dokumenttyp:Sonstiges
Veröffentlichungsform:Graue Literatur
Sprache:Deutsch
Titel des übergeordneten Werkes (Deutsch):Masterarbeit
Jahr der Erstveröffentlichung:2015
Gutachter*innen:Michael G. WellerORCiD, H. G. Börner
Verlag:Humboldt-Universität zu Berlin
Verlagsort:Berlin
Erste Seite:1
Letzte Seite:80
DDC-Klassifikation:Naturwissenschaften und Mathematik / Chemie / Analytische Chemie
Freie Schlagwörter:Merrifield; Tentagel
Fluorescence label; Ladder sequencing; MALDI-TOF-MS; Microarray; OBOC library; Peptide; Polymer beads; SPPS; Sequencing; Solid-phase peptide synthesis; Split and mix technology
Verfügbarkeit des Dokuments:Datei im Netzwerk der BAM verfügbar ("Closed Access")
Datum der Freischaltung:13.04.2022
Referierte Publikation:Nein
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