1.5 Proteinanalytik
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Organisationseinheit der BAM
Im Vergleich zu anderen Proteinen ist die Identifizierung von Antikörpern anhand ihrer Sequenz zum Beispiel mittels "peptide mass fingerprinting" schwierig. Da die Sequenzinformation eines Antikörpers aufgrund der hypersomatischen Mutation während der Affinitätsreifung nicht im Genom eines Organismus gespeichert ist, kann die Aminosäuresequenz nicht auf einfachem Weg der DNA-Sequenzierung gewonnen werden. Das ist nur in seltenen Fällen möglich, wenn dem Endanwender der Zellklon der Antikörper-produzierenden Zelle zugänglich ist. Eine Sequenzierung auf Protein-Ebene ist sehr aufwändig und teuer und wird daher fast nie für die Charakterisierung von analytischen Antikörpern verwendet. Der Mangel an Validierung dieser analytischen Antikörper, die bei Experimenten verwendeten werden, löst aber eine Reihe Probleme aus, die die Wiederholbarkeit dieser Experimente schwierig und in einigen Fällen unmöglich macht. Das sorgt jährlich für verschwendete Forschungsgelder in Milliardenhöhe und hindert den wissenschaftlichen Fortschritt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer einfachen und schnellen Methode, die es trotzdem ermöglicht, die Identifikation von Antikörpern sicherzustellen. Dazu wurde eine Methode basierend auf dem "peptide mass fingerprinting" gewählt. Das Problem der unbekannten Aminosäuresequenz der Antikörper wurde gelöst, indem lediglich die Peptidmuster der entstehenden Fingerprint-Spektren zur Identifikation herangezogen wurden. MALDI wurde dabei als Ionisationsmethode für die Massenspektrometrie gewählt, da die resultierenden Spektren im Gegensatz zu ESI-MS einfach auszuwerten sind. Auch kann auf eine vorige Trennung der Peptide mittels LC verzichtet werden, was zusätzlich Analysenzeit spart. Für die Proteinspaltung wurde eine simple saure Hydrolyse mittels Ameisensäure gewählt. Im Vergleich zum herkömmlichen Trypsin-Verdau konnten auf zeitraubende Arbeitsschritte wie Denaturierung, Reduktion und Alkylierung der Antikörper verzichtet werden. Die Hydrolyse mittels Ameisensäure wurde bisher nur auf kleine und mittelgroße Proteine angewendet, sodass im ersten Teil dieser Arbeit mehrere Schritte optimiert wurden bevor zufriedenstellende Fingerprint-Spektren von Antikörpern erhalten wurden.
In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Nanomaterialien auf ihre Bindungsfähigkeit zu Proteinen untersucht. Zu Beginn standen dabei die Herstellung stabiler Dispersionen der einzelnen Nanopartikel und die Stabilität der gebildeten Konjugate im Vordergrund. Der Nachweis einer erfolgreichen Konjugatbildung, sprich der Beschichtung von Nanopartikel mit Proteinen, wurde sowohl qualitativ mittels DLS-Messungen als auch über quantitative Protein-Bestimmungen erbracht. Für die Quantifizierung konnten verschiedene Methoden eingesetzt werden. Neben der klassischen Vorgehensweise, welche indirekt über die Quantifizierung von ungebundenem Protein im Überstand erfolgt, konnten ihm Rahmen dieser Arbeit verschiedene direkte Bestimmungsmethoden entwickelt werden. So wurden mittels kolorimetrischer Tests, wie dem BCA-Assay und dem Bradford-Assay, Nanodiamantdispersionen mit Hilfe einer Korrekturwellenlänge vermessen und quantifiziert. Ebenso zum Einsatz kam die Methode der Aminosäureanalytik, welche aufgrund ihrer guten Rückführbarkeit auf Aminosäurestandards Ergebnisse mit hoher Richtigkeit generieren kann und ebenso die Detektion kleiner Proteinmengen möglich macht.
Nach den erfolgten quantitativen Betrachtungen wurden die Protein-beschichteten Nanopartikel auf ihre Anwendbarkeit als Analoga von Virus-like Particles (VLP) bei einer Immunisierung zur Gewinnung von polyklonalen Antikörpern gegen humanes Ceruloplasmin in Kaninchen überprüft. Es konnte mittels ELISA gezeigt werden, dass die Konjugate erfolgreich für die Herstellung von Antikörpern eingesetzt werden können und im zeitlichen Verlauf einer Immunisierung eine Steigerung des Antikörper-Titers zu erreichen ist.
Preactivation crosslinking – An efficient method for the oriented immobilization of antibodies
(2019)
Crosslinking of proteins for their irreversible immobilization on surfaces is a proven and popular method. However, many protocols lead to random orientation and the formation of undefined or even inactive by-products. Most concepts to obtain a more targeted conjugation or immobilization requires the recombinant modification of at least one binding partner, which is often impractical or prohibitively expensive. Here a novel method is presented, which is based on the chemical preactivation of Protein A or G with selected conventional crosslinkers. In a second step, the antibody is added, which is subsequently crosslinked in the Fc part. This leads to an oriented and covalent immobilization of the immunoglobulin with a very high yield. Protocols for Protein A and Protein G with murine and human IgG are presented. This method may be useful for the preparation of columns for affinity chromatography, immunoprecipitation, antibodies conjugated to magnetic particles, permanent and oriented immobilization of antibodies in biosensor systems, microarrays, microtitration plates or any other system, where the loss of antibodies needs to be avoided, and maximum binding capacity is desired. This method is directly applicable even to antibodies in crude cell culture supernatants, raw sera or protein-stabilized antibody preparations without any purification nor enrichment of the IgG. This new method delivered much higher signals as a traditional method and, hence, seems to be preferable in many applications.
Preactivation Crosslinking - An Efficient Method for the Oriented Immobilization of Antibodies
(2019)
Crosslinking of proteins for their irreversible immobilization on surfaces is a proven and popular method. However, many protocols lead to random orientation and the formation of undefined or even inactive by-products. Most concepts to obtain a more targeted conjugation or immobilization requires the recombinant modification of at least one binding partner, which is often impractical or prohibitively expensive. Here a novel method is presented, which is based on the chemical preactivation of Protein A or G with selected conventional crosslinkers. In a second step, the antibody is added, which is subsequently crosslinked in the Fc part. This leads to an oriented and covalent immobilization of the immunoglobulin with a very high yield. Protocols for Protein A and Protein G with murine and human IgG are presented. This method may be useful for the preparation of columns for affinity chromatography, immunoprecipitation, antibodies conjugated to magnetic particles, permanent and oriented immobilization of antibodies in biosensor systems, microarrays, microtitration plates or any other system, where the loss of antibodies needs to be avoided, and maximum binding capacity is desired. This method is directly applicable even to antibodies in crude cell culture supernatants, raw sera or protein-stabilized antibody preparations without any purification nor enrichment of the IgG. This new method delivered much higher signals as a traditional method and, hence, seems to be preferable in many applications.