570 Biowissenschaften; Biologie
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Technische Prozesse können erheblich durch Biofilme beeinflußt werden und spielen in weiten Bereichen der Technik und Biotechnologie eine große Rolle. Ein zentrales Problem beim Einsatz von Werkstoffen in biologischen Systemen ist die Ansiedlung von Zellen und deren Stoffwechselprodukten auf Festkörperoberflächen. Erst hiervon gehen alle nachfolgenden Reaktionen aus, wie Kontamination von Implantaten und medizinischen Geräten, Biokorrosion und die Bildung von Biofilmen in technischen Geräten.
Die in der Biotechnologie eingesetzten Werkstoffe müssen bestimmten technischen und biologischen Forderungen genügen. Die Klärung der Adhäsionsmechanismen der Bakterien auf unterschiedlichen Werkstoffoberflächen und des sich aus einem ersten Zellhaufen entwickelnden Biofilms sowie die Reaktionen und die Transportmechanismen an und in ihm sind die Voraussetzung zur Interpretation der Werkstoffschädigung und des Zellverhaltens. Neben der konventionellen Licht- und Rasterelektronenmikroskopie steht mit der Raster-Kraft- Mikroskopie (SFM) ein neues Verfahren zur Abbildung von Oberflächen biologischer Systeme mit hoher Auflösung zur Verfügung. Ziel der Arbeiten ist es, mit dem SFM Untersuchungen von Biofilmen auf verschiedenen Werkstoffoberflächen durchzuführen. Hierzu ist es notwendig, die Raster-Kraft-Mikroskopie an die Besonderheiten biologischer Strukturen anzupassen. Aufgrund dieser Oberflächenuntersuchungen lassen sich dann geeignete Werkstoffe und Beschichtungen für den Einsatz in biologischen Systemen auswählen.
The SYSTERS project aims to provide a meaningful partitioning of the whole protein sequence space by a fully automatic procedure. A refined two-step algorithm assigns each protein to a family and a superfamily. The sequence data underlying SYSTERS release 4 now comprise several protein sequence databases derived from completely sequenced genomes (ENSEMBL, TAIR, SGD and GeneDB), in addition to the comprehensive Swiss-Prot/TrEMBL databases. The SYSTERS web server (http://systers.molgen.mpg.de) provides access to 158 153 SYSTERS protein families. To augment the automatically derived results, information from external databases like Pfam and Gene Ontology are added to the web server. Furthermore, users can retrieve pre-processed analyses of families like multiple alignments and phylogenetic trees. New query options comprise a batch retrieval tool for functional inference about families based on automatic keyword extraction from sequence annotations. A new access point, PhyloMatrix, allows the retrieval of phylogenetic profiles of SYSTERS families across organisms with completely sequenced genomes.
Das Enzym Superoxiddismutase (SOD) bietet wegen seiner hohen Reaktionsrate und seiner extrem hohen Substratspezifi tät große Vorteile für eine Anwendung als Superoxidbiosensor. In dieser Arbeit wurden durch molekularbiologische Methoden Mutanten der humanen Cu,Zn-SOD gewonnen, welche ein oder zwei zusätzliche Cystein-Reste enthielten, die eine einfache Immobilisierung des Proteins durch Bindung des Cystein-Schwefels auf Goldelektroden ermöglichten. Sechs solcher Mutanten wurden entworfen, exprimiert, aufgereinigt und elektrochemisch charakterisiert. Alle Mutanten konnten durch einen einfachen Inkubationsschritt auf Goldelektroden gebunden werden und zeigten ein quasi-reversibles elektrochemisches Ansprechen. Für eine Mutante wurde die Anwendung als Superoxidsensor genauer untersucht und für beide Teilreaktionen der Dismutation ein Ansprechen des Sensors auf das Radikal gefunden. Bei Verwendung einer Teilreaktion konnte die Empfindlichkeit herkömmlicher Monoschichtsensoren um etwa eine Größenordnung übertroffen werden.
Magnetische Nanopartikel besitzen Anwendungspotenzial in vielen biologischen und medizinischen Anwendungsgebieten. Superparamagnetische Magnetit-Nanopartikel werden klinisch verwendet als Kontrastmittel im Magnet-Resonanz-Imaging (MRI)und intensiv untersucht für Anwendungen wie Drug-Delivery-Systeme, Zell-Bewegungs-und Trenn-Systeme und Hyperthermie (1-5). Dabei sind Eisenoxid (Magnetit)-Nanopartikel besonders interessant, da sie größenabhängigen superparamagnetismus besitzen, nicht toxisch sind und im Organismus etabolisiert werden. Deshalb werden unterdessen Magnetit-Nanopartikel in vielen biomedizinischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt. Die Stabilität und Biokompatibilität der Magnetit-Nanopartikel sind von der Größe der Partikel und von der Oberflächenbeschichtung der Partikel in der Lösung abhängig. Die häufigste Methode zur Herstellung von superparamagnetischen Magnetit-Nanopartikeln ist die Kopräzipitation von Eisensalzen in der Gegenwart einer Base, meist Ammoniumhydroxid. Für biomedizinische Anwendungen sollte die Oberfläche der Magnetit-Partikel komplett mit einer Polymerschicht überzogen sein, um den Eisenoxidkern gegen die Blutproteine und Phagocytose-Rezeptoren abzuschirmen. Die üblichsten Beschichtungsmoleküle für biokompatible, auf Magnetit basierende Kolloide sind Derivate von Dextran und Polyethylenglycol. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neue Präparationsmethode von Magnetit-Protein-Partikeln durch direkte Kopräzipitation von Eisensalzen und Proteinen. Als Modellprotein wird Humanserumalbumin (HSA) verwendet, das als Hauptprotein des humanen Blutserums an der Oberfläche von Partikeln zur Verwendung in medizinischen Diagnostik- und Therapieverfahren sehr gute Voraussetzungen für die Biokompatibilität der Magnetit-Partikel besitzt. Dabei wurde gefunden, dass die meisten der primären Präzipitationsprodukte zunächst biologisch inaktiv (z. B. nicht von HSA-spezifischen Antikörpern erkennbar) sind und erst durch weitere chemische Aktivierungsschritte biologisch aktiviert werden können. Das Verfahren der chemische Aktivierung und dessen Optimierung wird beschrieben und eine Modellvorstellung für diesen Aktivierungsschritt präsentiert. Magnetit-Nanopartikel-Kopplungsprodukte mit unterschiedlichen Biomolekülen (z.B. Antikörpern, Protein A) gehören zu den für eine Verwendung in humanmedizinischen Strategien favorisierten Transportvehikeln für bioaktive Moleküle. Deshalb wurden die von uns erhaltenen Magnetit-HSA-Komplexe in einem zweistufigen Glutaraldehyd Verfahren chemisch aktiviert und kovalent mit Protein A und Antikörpern (IgG) gekoppelt.
Entwicklung eines impedimetrischen Biosensors für den Nachweis von Antigliadin Autoantikörpern
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Biosensor für den Nachweis von Antikörpern gegen Gliadin entwickelt. Gliadine sind Bestandteile der Getreideglutene und verantwortlich für die Manifestation der Zöliakie (Gluten-Unverträglichkeit). Der Biosensor basiert auf der Immobilisierung von Gliadin auf Goldelektroden, die zuvor mit Polystyrensulfonsäure beschichtet worden waren. Die erfolgreiche Immobilisierung wurde mit Hilfe der Quarzmikrowaage dokumentiert. Die Antigen-Antikörper-Bindung konnte durch die Inkubation mit einem Peroxidase-markierten Zweitantikörper und der enzymatischen Oxidation von 3-Amino-9- Ethylcarbazol (AEC) verstärkt werden. Die Zunahme in der Elektrodenisolierung durch die Bindungs- und Ablagerungsreaktion konnte durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) in Anwesenheit des Hexacyanoferrat- Redoxsystems gemessen werden. Die Spektren wurden mit Hilfe eines Randles-Ersatzschaltbildes ausgewertet. Hierbei konnte eine Zunahme im Ladungstransferwiderstand festgestellt werden, die pro portional zur Antigliadin-Antikörperkonzentration, im Bereich von 10-8 M bis 10-6 M, war. Mit Hilfe dieses Sensors wurden schließlich humane Seren hinsichtlich ihrer Konzentration an Gliadinantikörpern, sowohl für Immunglobuline vom Typ IgG als auch IgA, untersucht.
Im Rahmen des Projektes »CyToTest« soll, in Kooperation mit der Firma BioTeZ Berlin-Buch GmbH, ein System entwickelt werden, mit dem direkt am Gewässer auf einfache Art und Weise die Cyanobakterientoxinkonzentration ermittelt werden kann. Dazu ist es nötig Cyanobakterien zu kultivieren und die Toxine zu isolieren. Beides wird gebraucht, um einerseits das Messsystem entwickeln zu können und andererseits an der TFH Wildau ein Verfahren zu entwickeln, mit dem die Cyanobakterien direkt am Gewässer aufgeschlossen und die Toxine extrahiert werden können. Im Rahmen dessen wurden sechs Gattungen Cyanobakterien kultiviert und ein Verfahren etabliert, um die Biomasse kalkulieren zu können. Weiterhin wurde mit der Kalibration der HPLC mit Toxinen begonnen, um die Extrakte später prüfen zu können.
As a new class of therapeutic and diagnostic reagents, more than fifteen years ago RNA and DNA aptamers were identified as binding molecules to numerous small compounds, proteins and rarely even to complete pathogen particles. Most aptamers were isolated from complex libraries of synthetic nucleic acids by a process termed SELEX based on several selection and amplification steps. Here we report the application of a new one-step selection method (MonoLEX) to acquire high-affinity DNA aptamers binding Vaccinia virus used as a model organism for complex target structures.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Elektrodensystem aus MWCNT-modifizierten Goldelektroden mit kovalent fixierter Bilirubinoxidase elektrochemisch untersucht. Unter aeroben Bedingungen konnte ein DET von der Elektrode zur BOD durch die bioelektrokatalytische Reduktion von Sauerstoff zu Wasser detektiert werden. Das Startpotential der Elektrodenreaktion unter aeroben Bedingungen wurde mit etwa 720±10mV gegen SHE ermittelt. Mit dem hier beschriebenen Elektrodensystem sind in luftgesättigtem Puffer (bei 25±5°C) Stromdichten im Bereich von etwa 500 μA/cm2 möglich. Durch Ultraschallbehandlung der Kohlenstoffnanoröhren vor der Präparation, Variation der Auftragungsmenge und der BOD-Konzentration während der Immobilisierung konnte eine Erhöhung des voltammetrischen Meÿsignals erzielt werden. Weiterhin war dieses Elektrodensystem bei physiologischem pH-Wert und relativ hoher Ionenstärke einsetzbar und erwies sich im Vergleich zu anderen Proteinelektroden mit bis zu 2 Monaten als sehr lagerstabil. Unter anaeroben Bedingungen wurde ein Kupferzentrum der Bilirubinoxidase einer direkten Redoxumwandlung unterworfen. Der Nachweis dieses Redoxprozesses gelang erstmalig mit kovalent fixierter Bilirubinoxidase. Bei pH 7 in 100mM CiP-Puffer mit 25mV/s wurde ein formales Potential von etwa 680±10mV gegen SHE bestimmt. Dieses Potential entspricht in etwa den in den letzten Jahren publizierten Standardpotentialen für das T1-Kupferzentrum von BOD.[1] Weitere Experimente mit Bilirubin und den Inhibitoren NaF und NaN3 unter aeroben und anaeroben Bedingungen deuteten ebenfalls daraufhin, daÿ beim DET mit BOD die Elektronen von der Elektrode auf das T1-Zentrum übertragen werden.
Background
Tardigrades represent an animal phylum with extraordinary resistance to environmental stress.
Results
To gain insights into their stress-specific adaptation potential, major clusters of related and similar proteins are identified, as well as specific functional clusters delineated comparing all tardigrades and individual species (Milnesium tardigradum, Hypsibius dujardini, Echiniscus testudo, Tulinus stephaniae, Richtersius coronifer) and functional elements in tardigrade mRNAs are analysed. We find that 39.3% of the total sequences clustered in 58 clusters of more than 20 proteins. Among these are ten tardigrade specific as well as a number of stress-specific protein clusters. Tardigrade-specific functional adaptations include strong protein, DNA- and redox protection, maintenance and protein recycling. Specific regulatory elements regulate tardigrade mRNA stability such as lox P DICE elements whereas 14 other RNA elements of higher eukaryotes are not found. Further features of tardigrade specific adaption are rapidly identified by sequence and/or pattern search on the web-tool tardigrade analyzer http://waterbear.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de. The work-bench offers nucleotide pattern analysis for promotor and regulatory element detection (tardigrade specific; nrdb) as well as rapid COG search for function assignments including species-specific repositories of all analysed data.
Conclusion
Different protein clusters and regulatory elements implicated in tardigrade stress adaptations are analysed including unpublished tardigrade sequences.
mRNA-seq is a paradigm-shifting technology because of its superior sensitivity and dynamic range and its potential to capture transcriptomes in an agnostic fashion, i.e., independently of existing genome annotations. Implementation of the agnostic approach, however, has not yet been fully achieved. In particular, agnostic mapping of pre-mRNA splice sites has not been demonstrated. The present study pursued dual goals: (1) to advance mRNA-seq bioinformatics toward unbiased transcriptome capture and (2) to demonstrate its potential for discovery in neuroscience by applying the approach to an in vivo model of neurological disease. We have performed mRNA-seq on the L4 dorsal root ganglion (DRG) of rats with chronic neuropathic pain induced by spinal nerve ligation (SNL) of the neighboring (L5) spinal nerve. We found that 12.4% of known genes were induced and 7% were suppressed in the dysfunctional (but anatomically intact) L4 DRG 2 wk after SNL. These alterations persisted chronically (2 mo). Using a read cluster classifier with strong test characteristics (ROC area 97%), we discovered 10,464 novel exons. A new algorithm for agnostic mapping of pre-mRNA splice junctions (SJs) achieved a precision of 97%. Integration of information from all mRNA-seq read classes including SJs led to genome reannotations specifically relevant for the species used (rat), the anatomical site studied (DRG), and the neurological disease considered (pain); for example, a 64-exon coreceptor for the nociceptive transmitter substance P was identified, and 21.9% of newly discovered exons were shown to be dysregulated. Thus, mRNA-seq with agnostic analysis methods appears to provide a highly productive approach for in vivo transcriptomics in the nervous system.