FG Multiparameterdiagnostik
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The role of AJB35136 and fdtA genes in biofilm formation by avian pathogenic Escherichia coli
(2023)
Background Infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC) result in significant economic losses in poultry industry. APEC strains are known to form biofilms in various conditions allowing them to thrive even under harsh and nutrient-deficient conditions on different surfaces, and this ability enables them to evade chemical and biological eradication methods. Despite knowing the whole genome sequences of various APEC isolates, little has been reported regarding their biofilm-associated genes. A random transposon mutant library of the wild-type APEC IMT 5155 comprising 1,300 mutants was analyzed for biofilm formation under nutrient deprived conditions using Videoscan technology coupled with fluorescence microscopy. Seven transposon mutants were found to have reproducibly and significantly altered biofilm formation and their mutated genes were identified by arbitrary PCR and DNA sequencing. The intact genes were acquired from the wild-type strain, cloned in pACYC177 plasmid and transformed into the respective altered biofilm forming transposon mutants, and the biofilm formation was checked in comparison to the wild type and mutant strains under the same conditions.
Results In this study, we report seven genes i.e., nhaA, fdeC, yjhB, lysU, ecpR, AJB35136 and fdtA of APEC with significant contribution to biofilm formation. Reintroduction of AJB35136 and fdtA, reversed the altered phenotype proving that a significant role being played by these two O-antigen related genes in APEC biofilm formation. Presence of these seven genes across nonpathogenic E. coli and APEC genomes was also analyzed showing that they are more prevalent in the latter.
To increase our understanding of bacterial intestinal colonization in animal populations lacking anthropogenic influence we devised the first objective and studied the diversity of E. coli in pristine wild animal population. Overall, E. coli in cormorants maintained a high diversity under minimal anthropogenic influences. E. coli were isolated from individual birds of two cormorant colonies located on small islands in lakes at least 100 km away from human settlements. Diversity of the isolates was studied using pulsed field gel electrophoresis (PFGE). 137 isolates of cormorant colony-1 and 75 isolates of cormorant colony-2 resulted in 60 and 33 PFGE types, respectively. Representative strains of each PFGE type were analysed in terms of phylogroups, extraintestinal virulence associated genes (exVAGs), adhesion to the chicken intestinal cell line and antimicrobials. Most isolates belonged to phylogroup B1 (68.3%) followed by B2 and E with B2 harbouring the highest total number of exVAGs per isolate. Surprisingly, a PFGE type with relatively few exVAGs displayed the highest isolation frequency, also showing a high adhesion rate. Comparative analysis of exVAGs to other E. coli populations of wildlife origin revealed that the secreted autotransporter toxin encoding sat gene was only present in cormorants.
The second objective was to characterize and identify factors contributing to the novel adhesion phenotype, known as Clumpy adhesion by the strain 4972 E. coli when incubated on human urinary bladder 5637 cell line. Transcriptome and proteome of adhered bacteria clustered together and diverged from bacteria in the supernatant. The clumpy structure was further explored in terms antibiotic stress where sessile structures could tolerate high antibiotic pressure of ampicillin up to 16 mg/ml and gentamicin up to 2 µg/ml. Data analysis unveiled differential expression of 623 genes between bacteria forming clumps and in supernatant. 148 genes were hypothetical and five hypothetical genes i.e., ffp, espX1, pilV, spnT and yggT along with four known genes i.e., dnaK, spy, flgH and fimH were targeted for deletion. Seven genes deletion mutants, three known (i.e., spy, flgH and fimH) and four hypothetical (ffp, pilV, spnT and yggT) genes were successfully generated and analysed for various parameters. ΔflgH showed loss of clumpy phenotype and adhesion ability up to 80% was regenerated by complementation. When antibiotic stress by ampicillin was applied after clump formation, Δffp depicted no effect of high concentration of ampicillin. In case of ΔpilV, adhesion significantly increased to 151% and upon complementation, adhesion was reduced to 53%. ΔspnT during ampicillin stressed adhesion fared almost 8.5 times better than the wild type strain. ΔyggT exhibited high adhesion of 145.5 % and upon reintroduction, adhesion decreased to 13%. Overall, we were able characterize a new phenotype and determined the role of genes contributing to clumpy adhesion phenotype.
Für die Personalisierte Medizin wird eine präzise und schnelle Analyse relevanter kardiovaskulärer, Tumor- oder Autoimmunbiomarker in der heutigen Labordiagnostik immer wichtiger. Patienten sollen möglichst individuell und auf ihre Bedürfnisse abgestimmt behandelt werden. Mithilfe einfacher, tragbarer, zeit- und materialsparender Analysemethoden sollen in Zukunft die Ärzte durch automatisierte, multiparametrische Testsysteme unterstützt werden. Um diese Probleme adressieren zu können, ist es notwendig, Systeme zu entwickeln, die einen simultanen Nachweis von Protein-, Nukleinsäure-, und Lipidbiomarkern ermöglichen. Die vorliegende Dissertation setzt sich mit der Entwicklung mikropartikelbasierter Nachweissysteme für hydrophile und amphiphile Biomarker auseinander. Hierbei wurde ein mikropartikelbasierter Mikrofluidikchip zur Analyse von vier Protein- und DNAbasierten kardiovaskulären Biomarkern entwickelt. Dieser zeigt gegenüber der Verwendung einer Multiwellplatte eine Reduzierung der Zeit von 1 h auf 7 min, die Reduzierung von Patientenmaterial, aufgrund des Einsatzes geringer Volumina und eine erhöhte Sensitivität um einen Faktor von fünf gegenüber den Herstellerangaben der Biomarker. Die Analyse amphiphiler Biomarker wie Phospholipide oder Lipoproteine setzte die Verwendung hydrophober Mikropartikel voraus. Neuartige, fluoreszenzkodierte, hydrophobe Mikropartikel wurden hergestellt und anhand verschiedener Kriterien wie Verhalten in Puffersystemen, Hydrophobizität, Lösungsmittelstabilität und Fluoreszenz- und Größenverteilung charakterisiert. Mithilfe der typisierten hydrophoben Mikropartikel wurden amphiphile Biomarker, wie z. B. Anti-Phospholipid-Antikörper gegen Cardiolipin, welche bei Autoimmunerkrankungen, Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen eine Rolle spielen, an die Mikropartikeloberfläche gekoppelt. Ein aussagekräftiger Nachweis der Anti- Phospholipid-Antikörper konnte sowohl auf Membran- als auch Mikropartikelbasis entwickelt werden. Mit dem entwickelten Proof-of-Principle konnten erste Patientenseren analysiert und eine eindeutige Zuordnung der positiven und negativen Seren vorgenommen werden.
Nanopore sequencing, a third-generation sequencing technique that applies nanometre sized pores to transduce the physical and chemical properties of specific nucleobases into measurable electrical signals, shows attractive advantages over conventional next-generation sequencing techniques. However, primarily due to high sequencing error rates this technique has rarely been used so far in clinical laboratory diagnostics. In this cumulative dissertation Nanopore sequencing was established and validated in clinical diagnostics using the example of the molecular diagnosis of Familial Mediterranean fever (FMF) and SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infections. First, a novel data analysis pipeline for accurate single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping using Nanopore sequencing data was developed and validated with the corresponding sequencing protocol against conventional Sanger sequencing using 47 samples of patients with clinical suspicion of FMF. This method comparison showed a perfect agreement between both methods rendering current Nanopore sequencing in principle suitable for SNP genotyping in human genetics.
The bioinformatic analysis of sequencing data is one of the most challenging parts in Nanopore sequencing experiments and complicates the application in a clinical diagnostic setting. Therefore, six different bioinformatic tools for sequence alignment were evaluated regarding their applicability to Nanopore sequencing data. This evaluation revealed a good suitability of all except one of these tools although differences in quality and performance exist.
Since Nanopore sequencing showed a robust performance in SNP genotyping, a SARS-CoV-2 whole genome sequencing (WGS) protocol was established to enable onside viral WGS in a clinical laboratory. This was especially important for viral molecular biological surveillance during the pandemic as shown by analysing viral genetic data over the course of one year. Applying this approach in a clinical research project to investigate host-virus interaction by aggregating for the first time viral genetic data, serological data and clinical data, showed diverse humoral immune responses to SARS-CoV-2, that appear to be influenced by age, obesity and disease severity. Further, even small viral genetic changes may influence the clinical presentation of the associated disease COVID-19. Additionally, a novel reverse transcriptase (RT)- loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of SARS-CoV-2 was developed and validated for diagnostic use by method comparison with conventional RT-polymerase chain reaction (PCR). In summary, by presenting advancements of sequencing and bioinformatic workflows with the focus on an application in clinical diagnostics, the results of this thesis may pave the way for a broader application of Nanopore sequencing in laboratory medicine in the near future.
Biofilme sind Zusammenschlüsse von Mikroorganismen, die eingebettet in einer selbstproduzierten Matrix vor äußeren Umwelteinflüssen geschützt sind und eine erhöhte Toleranz gegenüber Antiinfektiva aufweisen. Im Bereich der Humanmedizin werden 65-80 % aller bakteriellen Infektionen mit Biofilmen assoziiert. Problematisch ist die fehlende Biofilmanalytik in der Routinediagnostik, die auch von der Europäischen Gesellschaft für klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten gefordert wird. So fehlen standardisierte Methoden für den mikroskopischen Nachweis einer Biofilm-assoziierten Infektion, die in situ Quantifizierung von Bakterien auf Implantaten und die Prüfung der Antibiotikaempfindlichkeit von Bakterien in Biofilmen. Mit den in dieser Arbeit etablierten Methoden wurden diese verschiedenen Schwerpunkte im Bereich der bakteriellen Biofilmanalytik beleuchtet. Basierend auf der an der Hochschule Lausitz entwickelten VideoScan-Technologie wurden fluoreszenzmikroskopische Methoden für die Untersuchung von Biofilmen entwickelt. Es wurde ein Modul geschaffen, welches qualitative und quantitative Aussagen über die allgemeine Fähigkeit von Bakterien zur Biofilmbildung treffen kann. Mit Anwendung dieser Methode konnte der Zusammenhang zwischen den genotypischen und phänotypischen Merkmalen von 187 klinischen E. coli-Isolaten und deren Biofilmbildung untersucht werden. Ein weiteres Modul erlaubte die Untersuchung der mit E. coli besiedelten Materialien Glas, Stahl und Titan. Insgesamt 44 Materialstücke (Coupons) wurden auf die Anzahl adhärenter Bakterien, die besiedelte Fläche und die maximal gebildete Biofilmdicke untersucht. Das dritte und letzte Modul fand Anwendung in der Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von S. aureus während der Biofilmbildung und unterschiedlich reifer S. aureus-Biofilme. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die etablierte Methode eine umfangreiche Analyse von Biofilmen für verschiedene Fragestellungen ermöglicht.
Die Entwicklung und Optimierung bioanalytischer Testsysteme erfordert zunehmend innovative und effiziente Strategien, um insbesondere den steigenden individuellen Anforderungen der personalisierten Medizin gerecht zu werden. Hierzu müssen stetig moderne Konzepte zur Charakterisierung potenzieller Biomarker untersucht und in schnell anpassbare diagnostische Anwendungen integriert werden. Gerade der sensitive und gleichzeitige Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist dabei von großem Interesse. Mit dieser Dissertation wurde die Entwicklung und Evaluierung spezifischer Hybridisierungssonden zum Nachweis viraler Nukleinsäuresequenzen in Zell- und Gewebemodellen mittels Fluoreszenzmikroskopie dargelegt. Hierbei zeigte sich, dass bei hinreichend großer Viruslast auch sehr kurze Sequenzbereiche effektiv detektiert werden können. Um zur Evaluierung von neuen Zielsubstanzen möglichst sensitive Aussagen treffen zu können, wurden weiterhin innovative Signalverstärkungstechnologien, insbesondere zur Analyse von Biomolekülen in mikropartikelbasierten Assays untersucht. Neben der erfolgreichen Übertragung der bereits für zellbasierte Anwendungen eingesetzten Tyramidsignalverstärkung auf Mikropartikel zeigten neuartige Nukleinsäurekonstrukte, sogenannte Origamis, großes Potential für zukünftige, sensitive Nachweisverfahren. Neben den einzelnen Assaykomponenten selbst sind zudem die Planung und der Aufbau von neuen Versuchssystemen entscheidend für einen erfolgreichen Einsatz in der Bioanalytik. Hier bieten moderne Fabrikationstechnologien, wie der 3D-Druck, enorme Vorteile für individuelle Untersuchungsmethoden. Diese Arbeit zeigte, dass entsprechend thermisch und fluoreszenzspektrometrisch charakterisierte Polymermaterialien gut für den funktionalen Einsatz in mikro-, zell- und molekularbiologischen Anwendungen geeignet sind und dadurch in Zukunft, bei kontinuierlicher Weiterentwicklung solcher maßgeschneiderten Systeme, rasch und wirksam auf neue diagnostische Fragestellungen und Bedürfnisse reagiert werden kann.
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind Erkrankungen, die den gesamten Gastrointestinaltrakt betreffen können. Sie werden unterteilt in die Hauptklassen Morbus Crohn (MC) und Colitis ulcerosa (CU). Da die Inzidenz dieser Erkrankungen weltweit steigt, ist es von besonderem Interesse, die Pathophysiologie sowie zugrundeliegende Signalwege und Zielantigene zu verstehen. Bisher wird vermutet, dass Umweltfaktoren, eine Fehlfunktion der Darmschleimhautbarriere und ein fehlreguliertes Immunsystem in genetisch prädisponierten Individuen bei der Manifestation der CED eine Rolle spielen. Eine Beteiligung der Immunantwort wird durch die Tatsache gestützt, dass krank-heitsspezifische Antikörper gegen körpereigene Bestandteile sowie gegen mikrobielle Antigene gefunden wurden.
In dieser Arbeit waren Anti-Neutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) von besonderem Interesse. ANCA erzeugen, abhängig vom Antigen, ein spezifisches Fluoreszenzmuster auf neutrophilen Granulozyten und können dadurch für die Diagnose bestimmter Erkrankungen genutzt werden. Eine spezielle Untergruppe, die atypischen ANCA, wurden mit CED und speziell CU assoziiert. Für atpyische ANCA wurde eine Vielzahl von neutrophilen Antigenen beschrieben, jedoch ist unklar, ob das Hauptantigen bereits identifiziert wurde.
Daher war das Ziel dieser Arbeit, neue neutrophile antigene Ziele zu identifizieren, die möglicherweise an der Erkennung der Darmmikrobiota sowie der Entzündung bei CED beteiligt sind. Dafür sollten neutrophile Granulozyten isoliert und ihre Proteine mittels verschiedener Methoden der Proteomik untersucht werden. Identifizierte Antigene sollten rekombinant exprimiert und für die Entwicklung eines immunologischen Testsystems genutzt werden.
Bei der Untersuchung der neutrophilen Proteine wurde das Molekül Chitinase-3-Like Protein 1 (CHI3L1) identifiziert und für die Entwicklung eines Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) genutzt. Dieser wurde genutzt, um das Serum von Patienten mit MC, CU oder Zöliakie sowie gesunde Kontrollen zu untersuchen. In Patienten mit MC zeigten sich signifikant höhere IgG-Reaktivitäten gegen CHI3L1 als in Patienten mit CU oder Zöliakie. IgA- und sekretorisches IgA (sIgA)-Reaktivitäten gegen CHI3L1 waren ebenfalls in Patienten mit MC signifikant höher als in CU, Zöliakie oder gesunden Kontrollen. Diese Daten zeigten, dass CHI3L1 ein neues neutrophiles antigenes Ziel in CED und speziell MC ist.
Es konnte keine Korrelation von CHI3L1-Antikörpern mit MC-spezifischen Anti-Saccharomyces cerevisiae-Antikörpern (ASCA) gezeigt werden. Die ROC-Analyse verschiedener klinischer Szenarien ergab, dass CHI3L1-Antikörper allein nicht für die klinische Anwendung geeignet sind. Allerdings könnten CHI3L1-Antikörper bestehende serologische Marker ergänzen und so zum Beispiel die Diagnostik verbessern. Ungeklärt bleibt, ob CHI3L1 eine Rolle in der Pathophysiologie von CED spielen könnte. Das Auftreten von Antikörpern gegen CHI3L1 deutet jedoch darauf hin.
Die Zunahme der Komplexität diagnostischer Fragestellungen veranlasst die Entwicklung von innovativen Teststrategien. Multiparameterteste sind eine Antwort auf die sich im Wandel befindende Routinediagnostik von Autoimmunerkrankungen.
In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurde eine neue multiparametrische Technologie für den Bereich der Autoimmundiagnostik entwickelt und klinisch evaluiert. Diese CytoBead Technologie ist eine Kombination aus Screeningtest, definiert durch die indirekte Immunfluoreszenz als diagnostischen Goldstandard, und einen multiplexen Bestätigungstest, welcher durch einen Mikropartikel-basierten Immunfluoreszenztest umgesetzt wurde.
Zur serologischen Diagnostik von anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern (ANCA) assoziierten Vaskulitiden wurde der CytoBead ANCA entwickelt. Dieser Multiparametertest beinhaltet eine Kombination aus indirekter Immunfluoreszenz mit Ethanol fixierten Granulozyten und Mikropartikel-basiertem Immunfluoreszenztest mit Proteinase 3 und Myeloperoxidase. Wesentliche Vorteile gegenüber den klassischen Testen sind Zeit- und Kosteneinsparungen, die in der Routinediagnostik unerlässlich sind. Unter der Prämisse der deutlichen Zeiteinsparung von mehreren Bearbeitungsstunden oder sogar Tagen wurde diese Technologie für verschiedene, krankheitsspezifische Bereiche als Werkzeug der Profildiagnostik entwickelt.
Besonders im Bereich der Notfalldiagnostik von Autoimmunerkrankungen zählt jede Stunde, wenn es um das Überleben der Patienten geht. Die Weiterentwicklung dieser Technologie für die serologische Diagnostik der Rapid Progressiver Glomerulonephritis (RPGN) als Notfalldiagnostik, ist ein wesentlicher Beitrag für eine effiziente in-vitro Diagnostik. Die sich anschließenden klinischen Studien des CytoBead ANCA und CytoBead RPGN wiesen gute bis sehr gute Vergleichbarkeiten zu klassischen Testen auf. Die Studien untermauerten zudem die Wichtigkeit der CytoBead Technologie hinsichtlich Nachhaltigkeit und Patientenmonitoring. Ein wichtiges Hauptaugenmerk der Testentwicklung lag in der Stabilität, Reproduzierbarkeit, Standardisierung und Quantifizierbarkeit von Ergebnissen, die im Rahmen dieser Dissertation evaluiert werden konnten.
Für eine weitere CytoBead Entwicklung und Evaluierung im Bereich der autoimmunen Lebererkrankungen konnte im Rahmen dieser Dissertation ein wichtiger Grundstein gelegt werden. Es wurde ein Screeningtest auf Basis der indirekten Immunfluoreszenz mit Glykoprotein 2 (Isoform 1,2,3,4) transduzierten HEp-2 Zellen entwickelt und anschließend in einer klinischen Studie evaluiert. Innerhalb dieser Studie konnte eine mögliche neue, autoantigene Zielstruktur für Patienten mit Primär Sklerodisierende Cholangitis identifiziert werden.
Zusammenfassend stellt sich die Entwicklung der CytoBead Technologie als eine neue, innovative Generation der serologischen Diagnostik von Autoimmunerkrankungen dar, welche zusätzlich auf verschiedene Diagnostikprofile angepasst werden kann.