FG Multiparameterdiagnostik
Refine
Document Type
- Doctoral thesis (8)
- Scientific article (4)
Has Fulltext
- yes (12)
Is part of the Bibliography
- no (12)
Keywords
- Escherichia coli (4)
- Adhesion (2)
- Adhäsion (2)
- Biofilm (2)
- Biomarker (2)
- Diagnostics (2)
- Gene (2)
- Zelladhäsion (2)
- 3D printing (1)
- 3D-Druck (1)
Institute
Das zymogene Granulamembranglykoprotein 2 (GP2) wird hauptsächlich in den Acinuszellen des Pankreas und auf den M-Zellen der Peyer-Plaques im Dünndarm exprimiert. Bakterien sind in der Lage, mittels Typ 1-Fimbrien (T1F) an Zuckerreste des GP2 und somit auch an Darmzellen zu binden. Das im Pankreas sezernierte und in den Darm ausgeschiedene GP2 kann demzufolge eine derartige bakterielle Adhäsion unterbinden. Ebenso ist die Initiierung einer spezifischen mukosalen Immunantwort durch an GP2 gebundene Bakterien möglich. T1F sind bei Enterobacteriaceae häufig vorkommende, adhäsive Oberflächenorganellen und stellen einen wichtigen Virulenzfaktor für die Adhäsion von pathogenen Escherichia coli an intestinale Zellen dar. Das eigentliche Adhäsin ist dabei das FimH-Protein an der Spitze der Fimbrie. Bisher haben nur wenige Studien die Adhäsion von E. coli an GP2 untersucht. Allerdings konnten schon mehrere Studien zeigen, dass eine Variation der FimH-Sequenz generell die Bindung von Bakterien an Wirtszellrezeptoren beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit war daher, die Adhäsion verschiedener E. coli-Pathotypen an GP2-Isoformen von drei unterschiedlichen Säugetierarten zu vergleichen und den Einfluss der FimH-Sequenzvariation auf die Bindung hin zu untersuchen. Dafür wurde zunächst die fimH-Sequenz von 180 E. coli-Stämmen der Pathotypen enteropathogene (EPEC), enterotoxische (ETEC) und kommensale E. coli vom Menschen, Rind und Schwein bestimmt. Zwei bovine GP2-Isoformen wurden in Sf9-Insektenzellen exprimiert, welche mit jeweils zwei GP2-Isoformen von Mensch und Schwein in Bakterienbindungsstudien verwendet wurden. Zudem wurde eine Korrelation zwischen der GP2-Bindung und der FimH-Expression untersucht. Für Untersuchungen zur GP2-FimH-Interaktion wurde die Oberflächenplasmonenresonanz eingesetzt. Außerdem wurde GP2 in bovinen Darmepithelzellen exprimiert und die Zellen für Adhäsionsstudien verwendet. Aus der fimH-Analyse resultierten 60 Allele und 30 FimH-Varianten. Die Bindung von E. coli an das GP2-Protein korrelierte mit der bakteriellen FimH-Expression. Obwohl einzelne E. coli-Stämme besser oder schlechter an bestimmte GP2-Isoformen adhärierten, war weder eine generelle wirts- noch pathotypspezifische Bindung nachzuweisen. Allerdings banden die FimH-Proteine besser an die langen GP2-Isoformen. Ähnliche Ergebnisse zeigten Bindungsstudien unter Nutzung von Darmepithelzellen, die auf ihrer Oberfläche GP2 exprimierten. Einzelne E. coli-Stämme banden besser oder schlechter, generelle Aussagen konnten nicht getroffen werden. Eine In-vitro-Infektionsstudie zeigte zudem, dass eine Vorbehandlung von E. coli mit GP2 eine Bindung dieser an Darmepithelzellen reduzierte.
The dissemination of antimicrobial resistance (AMR) in critical priority pathogens is a significant threat. Non-clinical reservoirs of AMR, such as agriculture and food production facilities, may contribute to the transmission of clinically relevant pathogens such as multidrug-resistant (MDR) Klebsiella pneumoniae. There is currently very limited knowledge regarding the population structure and genomic diversity of K. pneumoniae in poultry production in Pakistan. We explored healthy broilers in a commercial farm from Faisalabad, Pakistan, and identified six K. pneumoniae strains from 100 broiler birds. We characterized the strains, determining clonality, virulence and antimicrobial resistance genes using next generation sequencing. The evaluation of antimicrobial susceptibility revealed that all the strains were MDR. Genomic analysis showed that 3/6 strains belonged to ST152, harbouring acquired resistance aminoglycosides [aadA2, aph(4′)-Ia], β-lactams (blaSHV-187, blaLAP2), fosfomycin (fosA6), tetracycline (tetA), trimethoprim (dfrA12), quinolone (qnrS1), sulphonamides (sul2) and phenicol (floR). All the strains harboured the efflux pump genes oqxA, oqxB, emrR, kpnG, kpnH, kpnF, baeR, mtdB and mtdC. All six strains encoded identical virulence profiles possessing six genes, i.e., ureA, iutA, entB, allS, fimH and mrkD. Phylogenomic analysis of the dominant sequence type (ST152) present in our dataset with publicly available genomes showed that the isolates clustered to strains mainly from human sources and could pose a potential threat to food safety and public health. The combination of these findings with antimicrobial use data would allow a better understanding of the selective pressures that may be driving the spread of AMR. This is the first report of MDR K. pneumoniae isolated from broiler hens in Pakistan, and the finding suggests that routine surveillance of WHO critical priority pathogens in such settings would be beneficial to the development of effective control strategies to reduce AMR.
Neurodegenerative diseases (NDs) are characterized by abnormalities within neurons of the brain or spinal cord that gradually lose function, eventually leading to cell death. Upon examination of affected tissue, pathological changes reveal a loss of synapses, misfolded proteins, and activation of immune cells all indicative of disease progression before severe clinical symptoms become apparent. Early detection of NDs is crucial for potentially administering targeted medications that may delay disease advancement.
Given their complex pathophysiological features and diverse clinical symptoms, there is a pressing need for sensitive and effective diagnostic methods for NDs. Biomarkers such as microRNAs (miRNAs) have been identified as potential tools for detecting these diseases. We explore the pivotal role of miRNAs in the context of NDs, focusing on Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, multiple sclerosis, Huntington’s disease, and Amyotrophic Lateral Sclerosis. The review delves into the intricate relationship between aging and NDs, highlighting structural and functional alterations in the aging brain and their implications for disease development. It elucidates how miRNAs and RNA-binding proteins are implicated in the pathogenesis of NDs and underscores the importance of
investigating their expression and function in aging. Significantly, miRNAs exert substantial influence on post-translational modifications (PTMs), impacting not just the nervous system but a wide array of tissues and cell types as well. Specific miRNAs have been found to target proteins involved in ubiquitination or deubiquitination processes, which play a significant role in regulating protein function and stability. We discuss the link between miRNA, PTM, and NDs. Additionally, the review discusses the significance of miRNAs as biomarkers for early disease detection, offering insights into diagnostic strategies.
Escherichia coli intestinal infection pathotypes are characterized by distinct adhesion patterns, including the recently described clumpy adhesion phenotype. Here, we identify and characterize the genetic factors contributing to the clumpy adhesion of E. coli strain 4972. In this strain, the transcriptome and proteome of adhered bacteria were found to be distinct from planktonic bacteria in the supernatant. A total of 622 genes in the transcriptome were differentially expressed in bacteria present in clumps relative to the planktonic bacteria. Seven genes targeted for disruption had variable distribution in different pathotypes and non-pathogenic E. coli, with the pilV and spnT genes being the least frequent or absent from most groups. Deletion (Δ) of five differentially expressed genes, flgH, ffp, pilV, spnT, and yggT, affected motility, adhesion, or antibiotic stress. ΔflgH exhibited 80% decrease and ΔyggT depicted 184% increase in adhesion, and upon complementation, adhesion was significantly reduced to 13%. ΔflgH lost motility and was regenerated when complemented, whereas Δffp had significantly increased motility, and reintroduction of the same gene reduced it to the wild-type level. The clumps produced by Δffp and ΔspnT were more resistant and protected the bacteria, with ΔspnT showing the best clump formation in terms of ampicillin stress protection. ΔyggT had the lowest tolerance to gentamicin, where the antibiotic stress completely eliminated the bacteria. Overall, we were able to investigate the influence of clump formation on cell surface adhesion and antimicrobial tolerance, with the contribution of several factors crucial to clump formation on susceptibility to the selected antibiotics.
The role of AJB35136 and fdtA genes in biofilm formation by avian pathogenic Escherichia coli
(2023)
Background Infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC) result in significant economic losses in poultry industry. APEC strains are known to form biofilms in various conditions allowing them to thrive even under harsh and nutrient-deficient conditions on different surfaces, and this ability enables them to evade chemical and biological eradication methods. Despite knowing the whole genome sequences of various APEC isolates, little has been reported regarding their biofilm-associated genes. A random transposon mutant library of the wild-type APEC IMT 5155 comprising 1,300 mutants was analyzed for biofilm formation under nutrient deprived conditions using Videoscan technology coupled with fluorescence microscopy. Seven transposon mutants were found to have reproducibly and significantly altered biofilm formation and their mutated genes were identified by arbitrary PCR and DNA sequencing. The intact genes were acquired from the wild-type strain, cloned in pACYC177 plasmid and transformed into the respective altered biofilm forming transposon mutants, and the biofilm formation was checked in comparison to the wild type and mutant strains under the same conditions.
Results In this study, we report seven genes i.e., nhaA, fdeC, yjhB, lysU, ecpR, AJB35136 and fdtA of APEC with significant contribution to biofilm formation. Reintroduction of AJB35136 and fdtA, reversed the altered phenotype proving that a significant role being played by these two O-antigen related genes in APEC biofilm formation. Presence of these seven genes across nonpathogenic E. coli and APEC genomes was also analyzed showing that they are more prevalent in the latter.
To increase our understanding of bacterial intestinal colonization in animal populations lacking anthropogenic influence we devised the first objective and studied the diversity of E. coli in pristine wild animal population. Overall, E. coli in cormorants maintained a high diversity under minimal anthropogenic influences. E. coli were isolated from individual birds of two cormorant colonies located on small islands in lakes at least 100 km away from human settlements. Diversity of the isolates was studied using pulsed field gel electrophoresis (PFGE). 137 isolates of cormorant colony-1 and 75 isolates of cormorant colony-2 resulted in 60 and 33 PFGE types, respectively. Representative strains of each PFGE type were analysed in terms of phylogroups, extraintestinal virulence associated genes (exVAGs), adhesion to the chicken intestinal cell line and antimicrobials. Most isolates belonged to phylogroup B1 (68.3%) followed by B2 and E with B2 harbouring the highest total number of exVAGs per isolate. Surprisingly, a PFGE type with relatively few exVAGs displayed the highest isolation frequency, also showing a high adhesion rate. Comparative analysis of exVAGs to other E. coli populations of wildlife origin revealed that the secreted autotransporter toxin encoding sat gene was only present in cormorants.
The second objective was to characterize and identify factors contributing to the novel adhesion phenotype, known as Clumpy adhesion by the strain 4972 E. coli when incubated on human urinary bladder 5637 cell line. Transcriptome and proteome of adhered bacteria clustered together and diverged from bacteria in the supernatant. The clumpy structure was further explored in terms antibiotic stress where sessile structures could tolerate high antibiotic pressure of ampicillin up to 16 mg/ml and gentamicin up to 2 µg/ml. Data analysis unveiled differential expression of 623 genes between bacteria forming clumps and in supernatant. 148 genes were hypothetical and five hypothetical genes i.e., ffp, espX1, pilV, spnT and yggT along with four known genes i.e., dnaK, spy, flgH and fimH were targeted for deletion. Seven genes deletion mutants, three known (i.e., spy, flgH and fimH) and four hypothetical (ffp, pilV, spnT and yggT) genes were successfully generated and analysed for various parameters. ΔflgH showed loss of clumpy phenotype and adhesion ability up to 80% was regenerated by complementation. When antibiotic stress by ampicillin was applied after clump formation, Δffp depicted no effect of high concentration of ampicillin. In case of ΔpilV, adhesion significantly increased to 151% and upon complementation, adhesion was reduced to 53%. ΔspnT during ampicillin stressed adhesion fared almost 8.5 times better than the wild type strain. ΔyggT exhibited high adhesion of 145.5 % and upon reintroduction, adhesion decreased to 13%. Overall, we were able characterize a new phenotype and determined the role of genes contributing to clumpy adhesion phenotype.
Für die Personalisierte Medizin wird eine präzise und schnelle Analyse relevanter kardiovaskulärer, Tumor- oder Autoimmunbiomarker in der heutigen Labordiagnostik immer wichtiger. Patienten sollen möglichst individuell und auf ihre Bedürfnisse abgestimmt behandelt werden. Mithilfe einfacher, tragbarer, zeit- und materialsparender Analysemethoden sollen in Zukunft die Ärzte durch automatisierte, multiparametrische Testsysteme unterstützt werden. Um diese Probleme adressieren zu können, ist es notwendig, Systeme zu entwickeln, die einen simultanen Nachweis von Protein-, Nukleinsäure-, und Lipidbiomarkern ermöglichen. Die vorliegende Dissertation setzt sich mit der Entwicklung mikropartikelbasierter Nachweissysteme für hydrophile und amphiphile Biomarker auseinander. Hierbei wurde ein mikropartikelbasierter Mikrofluidikchip zur Analyse von vier Protein- und DNAbasierten kardiovaskulären Biomarkern entwickelt. Dieser zeigt gegenüber der Verwendung einer Multiwellplatte eine Reduzierung der Zeit von 1 h auf 7 min, die Reduzierung von Patientenmaterial, aufgrund des Einsatzes geringer Volumina und eine erhöhte Sensitivität um einen Faktor von fünf gegenüber den Herstellerangaben der Biomarker. Die Analyse amphiphiler Biomarker wie Phospholipide oder Lipoproteine setzte die Verwendung hydrophober Mikropartikel voraus. Neuartige, fluoreszenzkodierte, hydrophobe Mikropartikel wurden hergestellt und anhand verschiedener Kriterien wie Verhalten in Puffersystemen, Hydrophobizität, Lösungsmittelstabilität und Fluoreszenz- und Größenverteilung charakterisiert. Mithilfe der typisierten hydrophoben Mikropartikel wurden amphiphile Biomarker, wie z. B. Anti-Phospholipid-Antikörper gegen Cardiolipin, welche bei Autoimmunerkrankungen, Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen eine Rolle spielen, an die Mikropartikeloberfläche gekoppelt. Ein aussagekräftiger Nachweis der Anti- Phospholipid-Antikörper konnte sowohl auf Membran- als auch Mikropartikelbasis entwickelt werden. Mit dem entwickelten Proof-of-Principle konnten erste Patientenseren analysiert und eine eindeutige Zuordnung der positiven und negativen Seren vorgenommen werden.
Nanopore sequencing, a third-generation sequencing technique that applies nanometre sized pores to transduce the physical and chemical properties of specific nucleobases into measurable electrical signals, shows attractive advantages over conventional next-generation sequencing techniques. However, primarily due to high sequencing error rates this technique has rarely been used so far in clinical laboratory diagnostics. In this cumulative dissertation Nanopore sequencing was established and validated in clinical diagnostics using the example of the molecular diagnosis of Familial Mediterranean fever (FMF) and SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infections. First, a novel data analysis pipeline for accurate single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping using Nanopore sequencing data was developed and validated with the corresponding sequencing protocol against conventional Sanger sequencing using 47 samples of patients with clinical suspicion of FMF. This method comparison showed a perfect agreement between both methods rendering current Nanopore sequencing in principle suitable for SNP genotyping in human genetics.
The bioinformatic analysis of sequencing data is one of the most challenging parts in Nanopore sequencing experiments and complicates the application in a clinical diagnostic setting. Therefore, six different bioinformatic tools for sequence alignment were evaluated regarding their applicability to Nanopore sequencing data. This evaluation revealed a good suitability of all except one of these tools although differences in quality and performance exist.
Since Nanopore sequencing showed a robust performance in SNP genotyping, a SARS-CoV-2 whole genome sequencing (WGS) protocol was established to enable onside viral WGS in a clinical laboratory. This was especially important for viral molecular biological surveillance during the pandemic as shown by analysing viral genetic data over the course of one year. Applying this approach in a clinical research project to investigate host-virus interaction by aggregating for the first time viral genetic data, serological data and clinical data, showed diverse humoral immune responses to SARS-CoV-2, that appear to be influenced by age, obesity and disease severity. Further, even small viral genetic changes may influence the clinical presentation of the associated disease COVID-19. Additionally, a novel reverse transcriptase (RT)- loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of SARS-CoV-2 was developed and validated for diagnostic use by method comparison with conventional RT-polymerase chain reaction (PCR). In summary, by presenting advancements of sequencing and bioinformatic workflows with the focus on an application in clinical diagnostics, the results of this thesis may pave the way for a broader application of Nanopore sequencing in laboratory medicine in the near future.
Biofilme sind Zusammenschlüsse von Mikroorganismen, die eingebettet in einer selbstproduzierten Matrix vor äußeren Umwelteinflüssen geschützt sind und eine erhöhte Toleranz gegenüber Antiinfektiva aufweisen. Im Bereich der Humanmedizin werden 65-80 % aller bakteriellen Infektionen mit Biofilmen assoziiert. Problematisch ist die fehlende Biofilmanalytik in der Routinediagnostik, die auch von der Europäischen Gesellschaft für klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten gefordert wird. So fehlen standardisierte Methoden für den mikroskopischen Nachweis einer Biofilm-assoziierten Infektion, die in situ Quantifizierung von Bakterien auf Implantaten und die Prüfung der Antibiotikaempfindlichkeit von Bakterien in Biofilmen. Mit den in dieser Arbeit etablierten Methoden wurden diese verschiedenen Schwerpunkte im Bereich der bakteriellen Biofilmanalytik beleuchtet. Basierend auf der an der Hochschule Lausitz entwickelten VideoScan-Technologie wurden fluoreszenzmikroskopische Methoden für die Untersuchung von Biofilmen entwickelt. Es wurde ein Modul geschaffen, welches qualitative und quantitative Aussagen über die allgemeine Fähigkeit von Bakterien zur Biofilmbildung treffen kann. Mit Anwendung dieser Methode konnte der Zusammenhang zwischen den genotypischen und phänotypischen Merkmalen von 187 klinischen E. coli-Isolaten und deren Biofilmbildung untersucht werden. Ein weiteres Modul erlaubte die Untersuchung der mit E. coli besiedelten Materialien Glas, Stahl und Titan. Insgesamt 44 Materialstücke (Coupons) wurden auf die Anzahl adhärenter Bakterien, die besiedelte Fläche und die maximal gebildete Biofilmdicke untersucht. Das dritte und letzte Modul fand Anwendung in der Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von S. aureus während der Biofilmbildung und unterschiedlich reifer S. aureus-Biofilme. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die etablierte Methode eine umfangreiche Analyse von Biofilmen für verschiedene Fragestellungen ermöglicht.
Die Entwicklung und Optimierung bioanalytischer Testsysteme erfordert zunehmend innovative und effiziente Strategien, um insbesondere den steigenden individuellen Anforderungen der personalisierten Medizin gerecht zu werden. Hierzu müssen stetig moderne Konzepte zur Charakterisierung potenzieller Biomarker untersucht und in schnell anpassbare diagnostische Anwendungen integriert werden. Gerade der sensitive und gleichzeitige Nachweis spezifischer Nukleinsäuren ist dabei von großem Interesse. Mit dieser Dissertation wurde die Entwicklung und Evaluierung spezifischer Hybridisierungssonden zum Nachweis viraler Nukleinsäuresequenzen in Zell- und Gewebemodellen mittels Fluoreszenzmikroskopie dargelegt. Hierbei zeigte sich, dass bei hinreichend großer Viruslast auch sehr kurze Sequenzbereiche effektiv detektiert werden können. Um zur Evaluierung von neuen Zielsubstanzen möglichst sensitive Aussagen treffen zu können, wurden weiterhin innovative Signalverstärkungstechnologien, insbesondere zur Analyse von Biomolekülen in mikropartikelbasierten Assays untersucht. Neben der erfolgreichen Übertragung der bereits für zellbasierte Anwendungen eingesetzten Tyramidsignalverstärkung auf Mikropartikel zeigten neuartige Nukleinsäurekonstrukte, sogenannte Origamis, großes Potential für zukünftige, sensitive Nachweisverfahren. Neben den einzelnen Assaykomponenten selbst sind zudem die Planung und der Aufbau von neuen Versuchssystemen entscheidend für einen erfolgreichen Einsatz in der Bioanalytik. Hier bieten moderne Fabrikationstechnologien, wie der 3D-Druck, enorme Vorteile für individuelle Untersuchungsmethoden. Diese Arbeit zeigte, dass entsprechend thermisch und fluoreszenzspektrometrisch charakterisierte Polymermaterialien gut für den funktionalen Einsatz in mikro-, zell- und molekularbiologischen Anwendungen geeignet sind und dadurch in Zukunft, bei kontinuierlicher Weiterentwicklung solcher maßgeschneiderten Systeme, rasch und wirksam auf neue diagnostische Fragestellungen und Bedürfnisse reagiert werden kann.
