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Fully automated viability and toxicity screening : a reliable all-in-one attempt

Vollautomatisches Vitalitäts- und Toxizitätsscreening : ein zuverlässiger all-in-one Ansatz

  • The CRISPR/Cas9 technology is nowadays a common tool for genome editing to achieve new insights into, e.g., diagnostics and therapeutics in cancer and genetic disorders. Cell proliferation and anti-cancer drug response studies are widely used to evaluate the impact of editing. However, these assays are often time-consuming, expensive and reproducibility is an issue. To overcome this, we developed a fast and cheap assay that combines a fully automated multispectral fluorescence microscopy platform with a nuclei staining and open source software analysis. Here, we generated different LEDGF/p75 model cell lines to validate the effect on proliferation and chemosensitivity. Therefore, a fast protocol for an optimized all-in-one attempt for cytotoxicity screenings and proliferation analysis of adherent cells in a 96-well plate format was established using differential staining with two fluorescent dyes (Hoechst 33342 and propidium iodide) for live/dead cell discrimination. Subsequently, an automated cell nuclei count and analysis wasThe CRISPR/Cas9 technology is nowadays a common tool for genome editing to achieve new insights into, e.g., diagnostics and therapeutics in cancer and genetic disorders. Cell proliferation and anti-cancer drug response studies are widely used to evaluate the impact of editing. However, these assays are often time-consuming, expensive and reproducibility is an issue. To overcome this, we developed a fast and cheap assay that combines a fully automated multispectral fluorescence microscopy platform with a nuclei staining and open source software analysis. Here, we generated different LEDGF/p75 model cell lines to validate the effect on proliferation and chemosensitivity. Therefore, a fast protocol for an optimized all-in-one attempt for cytotoxicity screenings and proliferation analysis of adherent cells in a 96-well plate format was established using differential staining with two fluorescent dyes (Hoechst 33342 and propidium iodide) for live/dead cell discrimination. Subsequently, an automated cell nuclei count and analysis was performed using bioimage informatics. With the new established assay technology, up to 50000 cells/well can be detected and analyzed in a 96-well plate, resulting in a fast and accurate verification of viability and proliferation with consistency of 98 % compared to manual counting. Our screening revealed that LEDGF depletion using CRISPR/Cas9 showed a diminished proliferation and chemosensitivity independent of cell line origin. Moreover, LEDGF depletion caused a significant increase in 𝛾H2AX foci, indicating a substantial increase in DNA double strand breaks. LEDGF/p75 overexpression enhanced proliferation and chemoresistance underlining the role of LEDGF in DNA damage response. Independent of cancer cell type, LEDGF/p75 is a central player in DNA damage repair and is implicated in chemoresistance. Moreover, our automated fluorescence biosensor technology allowed fast and reliable data acquisition without any fixation or additional washing steps. Additionally, data analysis was implemented using modular open source software that can be adapted as needed.show moreshow less
  • Die CRISPR/Cas9-Technologie ist heute ein gängiges Werkzeug für die Genom-Editierung, um neue Erkenntnisse für z. B. die Diagnostik und Therapie von Krebserkrankungen und genetischen Störungen zu gewinnen Studien zur Zellproliferation und zum Ansprechen auf Krebsmedikamente werden häufig eingesetzt, um die Auswirkungen des Editierens zu bewerten. Diese Tests sind jedoch oft zeitaufwändig, teuer und in der Reproduzierbarkeit ungenau. Um dies zu überwinden, haben wir einen schnellen und kostengünstigen Test entwickelt, der eine vollautomatische multispektrale Fluoreszenzmikroskopie-Plattform mit einer Kernfärbung und einer Open-Source-Software-Analyse kombiniert.Wir haben verschiedene LEDGF/p75-Modellzelllinien generiert, um die Auswirkungen auf die Proliferation und Chemosensitivität zu validieren. Daher wurde ein schnelles Protokoll für einen optimierten All-in-One-Ansatz für Zytotoxizitäts-Screenings und Proliferationsanalysen von adhärenten Zellen in einem 96-Well-Plattenformat erstellt, bei dem eine differenzierte Färbung mit zweiDie CRISPR/Cas9-Technologie ist heute ein gängiges Werkzeug für die Genom-Editierung, um neue Erkenntnisse für z. B. die Diagnostik und Therapie von Krebserkrankungen und genetischen Störungen zu gewinnen Studien zur Zellproliferation und zum Ansprechen auf Krebsmedikamente werden häufig eingesetzt, um die Auswirkungen des Editierens zu bewerten. Diese Tests sind jedoch oft zeitaufwändig, teuer und in der Reproduzierbarkeit ungenau. Um dies zu überwinden, haben wir einen schnellen und kostengünstigen Test entwickelt, der eine vollautomatische multispektrale Fluoreszenzmikroskopie-Plattform mit einer Kernfärbung und einer Open-Source-Software-Analyse kombiniert.Wir haben verschiedene LEDGF/p75-Modellzelllinien generiert, um die Auswirkungen auf die Proliferation und Chemosensitivität zu validieren. Daher wurde ein schnelles Protokoll für einen optimierten All-in-One-Ansatz für Zytotoxizitäts-Screenings und Proliferationsanalysen von adhärenten Zellen in einem 96-Well-Plattenformat erstellt, bei dem eine differenzierte Färbung mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (Hoechst 33342 und Propidiumjodid) zur Unterscheidung von lebenden und toten Zellen verwendet wurde. Anschließend wurde eine automatische Zählung und Analyse der Zellkerne mit Hilfe der Bioimage-Informatik durchgeführt. Mit der neuen etablierten Assay-Technologie können bis zu 50.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte nachgewiesen und analysiert werden, was eine schnelle und genaue Überprüfung der Lebensfähigkeit und Proliferation mit einer Übereinstimmung von 98 % im Vergleich zur manuellen Zählung ermöglicht. Unser Screening ergab, dass die Deletion von LEDGF mit CRISPR/Cas9 eine verringerte Proliferation und Chemosensitivität, unabhängig von der Herkunft der Zelllinie, zur Folge hatte. Darüber hinaus führte die Deletion von LEDGF zu einer signifikanten Zunahme von 𝛾H2AX-Foci, was auf eine erhebliche Zunahme von DNA-Doppelstrangbrüchen hinweist. Die Überexpression von LEDGF/p75 erhöhte die Proliferation und Chemoresistenz, was die Rolle von LEDGF bei der DNA-Schadensreaktion unterstreicht. Unabhängig vom Krebszelltyp ist LEDGF/p75 ein zentraler Akteur bei der DNA-Schadensreparatur und ist an der Chemoresistenz beteiligt. Darüber hinaus ermöglichte unsere automatisierte Fluoreszenz-Biosensor-Technologie eine schnelle und zuverlässige Datenerfassung ohne Fixierung oder zusätzliche Waschschritte. Darüber hinaus wurde die Datenanalyse mit einer modularen Open-Source-Software durchgeführt, die je nach Bedarf angepasst werden kann.show moreshow less

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Metadaten
Author: Victoria LiedtkeORCiD, Romano WeissORCiD, Anastasia SkifovORCiD, Stefan RödigerORCiD, Lysann SchenkORCiD
DOI:https://doi.org/10.1002/cam4.7392
ISSN:2045-7634
Parent Title (English):Cancer Medicine
Publisher:Wiley
Place of publication:Weinheim
Document Type:Scientific article
Language:English
Year of Completion:2023
Year of first Publication:2024
Release Date:2024/07/26
Tag:Automatisiertes System; Bioimage-Informatik; Vitalität; Zytotoxizität
Automated system; Bioimage informatics; CRISPR/Cas9; Cytotoxicity; Viability
GND Keyword:Multiparameteranalyse; Fluoreszenzmikroskopie; Cytotoxizität; Proliferation; Vitalität
Volume:13
Issue:12
Article Number:e7392
Fundername (not EU):Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) / Open-Access-Publikationskosten (2023 -2025) / 512881332
Fundername (not EU):Bundesministerium für Bildung und Forschung / 03WKDB2C
Institutes:Fakultät 2 Umwelt und Naturwissenschaften / FG Molekularbiologie
Licence (German):Creative Commons - CC BY - Namensnennung 4.0 International
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