Wissenschaftliche Beiträge
Refine
Document Type
Year of publication
Institute
Language
- German (15)
Has Fulltext
- yes (15)
Is part of the Bibliography
- yes (15)
Die funktionale Kopplung von photoaktiven Nanostrukturen mit Enzymen stellt eine neue Strategie zum Aufbau lichtgesteuerter biohybrider Systeme dar. Hier sind Untersuchungen zusammengefasst, welche die effiziente Kontaktierung der FAD-abhängigen Glukosedehydrogenase (FAD-GDH) mit Hilfe eines Osmium-Redoxpolymers (P Os ) an PbS-Quantum Dots (PbS QDs) zeigen, welche direkt auf dreidimensionalen TiO 2 -Elektrodenstrukturen synthetisiert wurden. Diese biohybriden Strukturen erlauben die Licht-induzierte Oxidation von Glukose. Dazu wird zunächst ein Verfahren vorgestellt, bei welchem durch den Aufbau invers-opaler TiO 2 (IO-TiO 2 ) Strukturen hohe Bindungskapazitäten für die Integration von QDs, Redoxpolymer und Enzym erreicht werden. In Folge wird gezeigt wie elektrochemische Signalketten durch Licht gesteuert werden können, indem Ladungsträger in den QDs unter Beleuchtung erzeugt werden. Diese Aktivierung ermöglicht dann die Ausbildung einer Elektrontransferkaskade vom Enzym über das Redoxpolymer zu den QDs und final zur IO-TiO 2 -Elektrode. Die resultierenden anodischen Photoströme können durch das Potential, die Lichtintensität und die Glukosekonzentration moduliert werden. So können in Anwesenheit von Glukose Photoströme von bis zu 207 μA/cm2 und erste Oxidationssignale bereits bei einem Potential von -540 mV vs Ag/AgCl, 1 M KCl erhalten werden. Dies entspricht einem Potentialgewinn von über 500 mV im Vergleich zu nicht lichtsensitiven Elektroden. Das vorgestellte biohybride System kombiniert Vorteile einer großen Oberfläche (durch IO-TiO 2 -Struktur), die effiziente Ladungsträgergenerierung und -trennung an der QD/TiO 2 -Schnittstelle sowie die effiziente Kontaktierung von FAD-GDH mit den QDs mit Hilfe eines Redoxpolymers. Die Ergebnisse verdeutlichen das Potential dieser leistungsfähigen Photobioanode für die Sensorik und die Erzeugung von Energie aus Licht und Glukose.
Die Kombination von fortschrittlichen Materialien und kontrolliertem Oberflächendesign mit komplexen Proteinen aus der natürlichen Photosynthese ist derzeit eines der Hauptthemen bei der Entwicklung von Biohybridsystemen und Biophotovoltaik. In dieser Studie werden transparente makroporöse Indium-Zinn-Oxid-(μITO-) Elektroden mit dem trimeren Superkomplex Photosystem I (PSI) aus dem Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus sowie dem kleinen Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c) kombiniert, um neuartige und effiziente biohybride Photokathoden herzustellen. Mit diesen bis zu 40 μm hohen 3D-Strukturen können beide Proteine in einer annähernden Monolage abgeschieden werden und die elektrische Kommunikation mit der Elektrode kann erzielt werden. Der generierte Photostrom folgt dabei linear der kontrollierbaren Schichtdicke der μITO-Elektrode, wobei
Stromdichten von bis zu 150 μA cm –2 erhalten werden. Eine effiziente elektrische Kopplung der Proteine kann durch die hohe interne Quanteneffizienz von 30 % gezeigt werden.
Die Flavin-abhängige Fruktosedehydrogenase und Cytochrom c: Elektronentransfer und Sensorstrategien
(2017)
Die hier durchgeführten Untersuchungen ermöglichen ein besseres Verständnis der Elektronentransferprozesse zwischen der Flavin-abhängigen Fruktosedehydrogenase (FDH) und dem Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c). Dies liefert im Hinblick auf sensorische Anwendungen wichtige Erkenntnisse für vorteilhafte Sensorarchitekturen und deren Messbedingungen. Es wurden zwei unterschiedliche pH-Optima für die Redoxreaktion der beiden Proteine untereinander entdeckt. Die Reaktion wurde im Weiteren mit Elektroden kombiniert und so eine Fruktose-abhängige Stromantwort detektiert. Darüber hinaus konnten definierte dreidimensionale Sensorarchitekturen der beiden Proteine, mit Hilfe von DNA als zusätzlichen biologischen Baustein erzeugt und für die Sensorik genutzt werden.
Es wurde ein dreidimensionales Polymerfasernetzwerk aufgebaut, charakterisiert und anschließend daran das Enzym Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glukosedehydrogenase (PQQ)GDH gebunden. Das Polymerfasernetzwerk wurde durch Elektrospinnen einer Mischung des Polymers Polyacrylnitril und verschiedener leitfähiger Polymere der Polyanilin-Familie auf Indium-Zinn-Oxid-Elektroden aufgebracht. Die so hergestellten Fasermatten erwiesen sich bei mikroskopischen Untersuchungen gleichförmig präpariert und die Faserdurchmesser bewegten sich im Bereich weniger hundert Nanometer. Das Redoxpaar Kaliumhexacyanoferrat (II/III) zeigte an diesen Polymer-Elektrodenstrukturen eine quasi-reversible Elektrochemie. Bei weitergehenden Untersuchungen an den enzymmodifizierten Fasern ((PQQ)GDH) konnten unter Substratzugabe (Glukose) bioelektrokatalytische Ströme nachgewiesen werden. Das Fasernetzwerk fungiert hier nicht nur als Immobilisierungsmatrix, sondern als auch als Teil des Signalwandlers.
Das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) startete 1999 mit dem InnoRegio-Wettbewerb eine neuartige Förderinitiative unter der Leitidee „Innovative Impulse in den Neuen Ländern“. In zahlreichen Regionen wurden Aktivitäten in Gang gesetzt, um neue Formen der Zusammenarbeit von Menschen aus den unterschiedlichsten Bereichen zu entwickeln und damit die Wertschöpfung und Wettbewerbsfähigkeit in den ostdeutschen Regionen zu erhöhen. An dieser Ausschreibung nahmen in der Anfangsphase 444 Bewerberregionen teil. Nach der ersten Jury-Sitzung im Oktober 1999 wurden 50 InnoRegios ausgewählt, in einer Entwicklungsphase ihre Kernkompetenzen herauszufiltern und tragfähige Innovationskonzepte zu erarbeiten. Mit der zweiten Jury-Sitzung im Herbst 2000 fiel der Startschuss zur Umsetzungsphase. Zur Zeit werden vom BMBF 23 InnoRegios in den Neuen Ländern gefördert.
Diese Studie beschreibt einen labelfreien impedimetrischen Sensor auf der Grundlage von kurzen einzelsträngigen DNA-Erkennungselementen für den Nachweis von Hybridisierungsereignissen. Der Fokus der Arbeit liegt auf der Aufklärung des Einflusses der Ziel-DNA-Länge und der Erkennungssequenzposition auf die sensorische Leistungsfähigkeit. Die impedimetrischen Messungen werden in Anwesenheit des Redoxsystems Kaliumhexacyanoferrat (II/III) durchgeführt und zeigen einen Anstieg des Durchtrittswiderstandes nach der Hybridisierung mit komplementärer Ziel-DNA mit einer Nachweisgrenze im unteren nanomolaren Bereich. Nach der Hybridisierung kann die Regeneration des Sensors mit deionisiertem Wasser durch die Einstellung effektiver Konvektionsbedingungen erreicht werden und ermöglicht somit eine Wiederverwendbarkeit des Sensors. Untersuchungen zu längeren Ziel-DNA-Strängen mit einem zur Lösung exponierten Überhang demonstrieren die Anwendbarkeit des impedimetrischen Nachweises für längere Sequenzen. Allerdings resultiert eine zunehmende Überhanglänge in einer verringerten Durchtrittswiderstandsänderung. Um die Impedanzänderung für längere Ziel-DNA zu erhöhen, wird die Erkennungssequenzposition verändert, sodass ein kleiner Überhang zur Elektrode ausgerichtet ist. Die Ergebnisse legen nahe, dass DNA in direkter Nähe zur Elektrode einen größeren Einfluss auf das impedimetrische Signal besitzt als weiter entfernte DNA.
Sulfonierte Polyaniline erwiesen sich bereits als geeignete Polymere für den Aufbau von Biosensoren. Aus diesem Grund setzten wir unterschiedlich substituierte Polymerformen für die Untersuchungen der direkten Elektronenübertragung zum Redoxenzym PQQ-GDH (Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glukosedehydrogenase) ein. Dafür wurden zuerst neue Copolymere synthetisiert. Als Basis für die Synthesen wurden 2-Methoxyanilin-5-Sulfonsäure (MAS), 3-Aminobenzensulfonsäure (ABS), 3-Aminobenzoesäure (AB) und Anilin (AN) ausgewählt und deren Verhältnisse variiert. Alle Copolymere wurden hinsichtlich der direkten Reaktion mit PQQ-GDH untersucht. Diese Wechselwirkung wurde zunächst in Lösung, anschließend auch auf Elektroden beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass nur die aus MAS- und AN-Einheiten bestehenden Copolymere in der Lage sind, mit dem Enzym in Lösung direkt zu interagieren, was wahrscheinlich dem Emeraldin Salz (ES) Redoxzustand des Polymers zuzuschreiben ist. Immobilisiert man die Polymere und das Enzym auf Kohlenstoffnanoröhrenbasierten Elektroden, generiert man direkte Bioelektrokatalyse auch im Falle der aus ABS/AB- und MAS/AB-Einheiten bestehenden Copolymere, die sich nach der Synthese im Pernigranilin Base (PB) Redoxzustand befinden. Im Gegensatz zur Situation in Lösung kann auf Elektroden das Potential zusätzlich genutzt werden, um Elektronen vom Enzym auf das Polymer zu übertragen. Solche Polymerbasierten Enzymelektroden besitzen Anwendungspotential in der Sensorik, aber auch in Biobrennstoffzellen.
In dieser Studie präsentieren wir eine Enzymelektrode, bei der ein direkter Elektronentransfer (DET) zwischen der Pyrrolochinolinchinon-abhängigen Glukosedehydrogenase (PQQ)-GDH und einer Elektrode realisiert werden konnte. Hierfür wird eine Goldelektrode mit mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren [engl. multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)] modifiziert, anschließend mit einem Copolymer aus Anilinderivaten überzogen und dann die (PQQ)-GDH (Acinetobacter calcoaceticus) kovalent immobilisiert. Die gepulste Polymersynthese wird hinsichtlich der Effektivität der bioelektrokatalytischen Umsetzung von Glukose optimiert. Die Glukoseoxidation startet bei einem Potential von -0,1 V vs. Ag/AgCl (1 M KCl) und Stromdichten von bis zu 500 μA/cm² (+0,1 V) können erreicht werden. Der Messbereich für Glukose liegt bei 0,1-5 mM (+0,1 V vs. Ag/AgCl). Der dynamische Bereich ist bei höherem Potential auf bis zu 100 mM (+0,4 V vs Ag/AgCl) erweitert. Die Elektrode wird als Anode in einer Biobrennstoffzelle (BBZ) mit einer Bilirubinoxidase-modifizierten MWCNT/Gold-Kathode eingesetzt. Beide Elektroden basieren auf einem DET. Das Zellpotential der BBZ beträgt 680 ±20 mV und sie erreicht eine maximale Leistungsdichte von 65 μW/cm² (bei einer Zellspannung von 350 mV).
Diese Studie beschäftigt sich mit der Untersuchung der Sauerstoffsensitivität von QD-Elektroden auf Basis von CdSe/ZnS-Nanopartikeln. Das Verhalten des sauerstoffabhängigen Photostroms wurde dabei in Abhängigkeit des pH-Wertes und des Potentials untersucht. Auf Grundlage dieser Sauerstoffabhängigkeit wurde die Enzymaktivität von GOD über Photostrommessungen evaluiert. Für die Konstruktion eines photobioelektrochemischen Sensors, der durch Beleuchtung der entsprechenden Elektrodenfläche ausgelesen werden kann, wurden Multischichten auf die CdSe/ZnS-modifizierten Elektroden aufgetragen. Die Layer-by-Layer Deposition von GOD mit Hilfe des Polyelektrolyten PAH zeigte, dass eine Sensorkonstruktion möglich ist. Die Sensoreigenschaften dieser Elektroden werden drastisch durch die Menge an immobilisiertem Enzym auf der Quantum Dot-Schicht beeinflusst. Durch die Präparation von vier Bilayern [GOD/PAH]4 an CdSe/ ZnS Elektroden kann ein schnell ansprechbarer Sensor für Konzentrationen zwischen 0.1 – 5 mM Glukose hergestellt werden. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Multianalytdetektion mit nichtstrukturierten Sensorelektroden, lokalisierten Enzymen und räumlich aufgelöster Auslesung durch Licht.
Labelfreie Detektion von Protein-DNA-Interaktionen durch elektrochemische Impedanzspektroskopie
(2012)
Es wird ein impedimetrisches Sensorsystem für den Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen vorgestellt. Der Sensor nutzt kurze Thiol-markierte DNA (ssDNA), die über Chemisorption auf Goldchipelektroden immobilisiert wird. Aus den Impedanzspektren wurde der Durchtrittswiderstand (Rct) als Kenngröße für die zu untersuchenden Wechselwirkungen gewählt. In Anwesenheit des Redoxsystems Ferro-/Ferrycyanid konnte eine Zunahme des Durchtrittswiderstandes nach der Immobilisierung und anschließender Hybridisierung auf der Sensoroberfl äche registriert werden. Der Einsatz längerer Fänger-DNA (25- mer im Vergleich zu 18-mer) führte zu einer Abnahme der Konzentration an immobilisierten Fänger-Strängen, aber auch zu einer Vergrößerung der Durchtrittswiderstände sowohl für ssDNA als auch dsDNA. Bei ähnlichen Oberflächenkonzentrationen ließ sich eine annähernd gleiche Sensitivität des Hybridisierungsnachweises im Vergleich zu 18-mer Fänger-Strängen erzielen. Mit Hilfe des Elektrodensystems wurde die Nachweisbarkeit von Protein-DNA-Wechselwirkungen untersucht. Die Restriktion doppelsträngiger DNA durch die Restriktionsendonuklease BamHI konnte mit der Zyklovoltammetrie und markierungsfrei mit der Impedanzspektroskopie verfolgt werden. Des Weiteren wurde die sequenzspezifische Bindung des Transkriptionsfaktors NF-κB p50 an
Unter Verwendung von mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren wurde in dieser Studie eine neuartige Anode zum Einsatz in Biobrennstoffzellen entwickelt. Dazu wurde das rekombinante Enzym Pyrrolochinolinchinon(PQQ)- abhängige Glucosedehydrogenase kovalent an eine aus PQQ bestehenden Zwischenschicht gekoppelt, welche zuvor an die Kohlenstoffnanoröhren adsorbiert war. Die Nanoröhren wurden aufgrund ihrer Thiolmodifikation chemisorptiv auf einer Goldelektrode gebunden. In glucosehaltiger Lösung konnte der Start eines katalytischen Stroms bei einem Potential von -80 mV vs. Ag/AgCl (1 MKCl) beobachtet werden. Unter Substratsättigung wurden Stromdichten im Bereich von 170 bis 200 μA/cm2 gemessen. Dieses System basiert auf einem mediatorvermittelten Elektronentransfer. Die entwickelte (PQQ)-GDH-MWCNT-Elektrode wurde mit einer MWCNT-modifizierten Elektrode kombiniert, bei der Bilirubinoxidase (BOD) als Biokatalysator fungiert. Daraus resultierte eine membranfreie Biobrennstoffzelle mit einem leichgewichtspotential von 600 mV und Leistungsdichten im Bereich von 20-25 μW/cm2.
Es wurde ein Elektrodensystem entwickelt, das aufbauend auf Halbleiternanopartikeln (so genannte Quantenpunkte) die sensitive Detektion des Enzymkofaktors NADH (nicotinamide adenine dinucleotide) erlaubt. Kolloidale halbleitende CdSe/ZnS-Nanokristalle sind durch ein Dithiol über Chemisorption an Gold gebunden. Das Stromsignal kann durch die Beleuchtung der Quantenpunkt modifizierten Oberfläche beeinflusst werden. Durch Photoanregung entstehen Elektron-Loch- Paare in den Nanopartikeln, die als anodischer oder kathodischer Photostrom detektiert werden können. Die Immobilisierung der Nanokristalle ist durch amperometrische Photostrom- und Quarzmikrowaage-Messungen (quartz crystal microbalance) verifiziert. Diese Studie zeigt, dass CdSe/ZnS-Quantenpunktmodifizierte Elektroden eine konzentrationsabhängige NADH-Detektion im Bereich von 20μM bis 2mM bei relativ niedrigem Potential (um 0V vs Ag/AgCl, 1 M KCl) ermöglichen. Somit können solche Elektroden in Kombination mit NADH-produzierenden Reaktionen für die lichtgesteuerte Analyse der entsprechenden Substrate des Biokatalysators genutzt werden. Es wird gezeigt, dass mit einem solchen Elektrodensystem und Photostrommessungen ein Glukosenachweis möglich ist.
Im folgenden Artikel werden einfache DNA-Sensoren vorgestellt, mit deren Hilfe es durch voltammetrische und impedimetrische Messmethoden möglich ist, schnell, sensitiv und kostengünstig Einzelstrang-DNA (ssDNA) nachzuweisen. Beide Messprinzipien lassen neben der spezifischen Detektion auch die Quantifizierung von DNA-Sequenzen sowie den Nachweis von einzelnen Basenfehlpaarungen innerhalb dieser Sequenzen zu. Fänger- DNA wurde zu diesem Zweck mit dem 5’-Ende auf einer Goldoberfläche immobilisiert. Die Hybridisierung mit einem Methylenblau (MB) markierten oder unmarkierten Probenstrang konnte dann mit Hilfe der Differenzpulsvoltammetrie DPV oder der elektrochemischen Impedanzspektroskopie nachgewiesen werden. Die voltammetrische Quantifizierung erfolgte in einem direkten und kompetitiven Ansatz, mit einem Detektionslimit von 30 nM bzw. 3 nM (bei Einsatz von 0,1 μM Kompetitor- DNA). Das Detektionslimit beim impedimetrischen Nachweis lag bei 100 nM DNA. Die hier vorgestellten Sensoren sind zum einen regenerierbar und können zum anderen über einen Zeitraum von zwei Monaten gelagert werden.
Entwicklung eines impedimetrischen Biosensors für den Nachweis von Antigliadin Autoantikörpern
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Biosensor für den Nachweis von Antikörpern gegen Gliadin entwickelt. Gliadine sind Bestandteile der Getreideglutene und verantwortlich für die Manifestation der Zöliakie (Gluten-Unverträglichkeit). Der Biosensor basiert auf der Immobilisierung von Gliadin auf Goldelektroden, die zuvor mit Polystyrensulfonsäure beschichtet worden waren. Die erfolgreiche Immobilisierung wurde mit Hilfe der Quarzmikrowaage dokumentiert. Die Antigen-Antikörper-Bindung konnte durch die Inkubation mit einem Peroxidase-markierten Zweitantikörper und der enzymatischen Oxidation von 3-Amino-9- Ethylcarbazol (AEC) verstärkt werden. Die Zunahme in der Elektrodenisolierung durch die Bindungs- und Ablagerungsreaktion konnte durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) in Anwesenheit des Hexacyanoferrat- Redoxsystems gemessen werden. Die Spektren wurden mit Hilfe eines Randles-Ersatzschaltbildes ausgewertet. Hierbei konnte eine Zunahme im Ladungstransferwiderstand festgestellt werden, die pro portional zur Antigliadin-Antikörperkonzentration, im Bereich von 10-8 M bis 10-6 M, war. Mit Hilfe dieses Sensors wurden schließlich humane Seren hinsichtlich ihrer Konzentration an Gliadinantikörpern, sowohl für Immunglobuline vom Typ IgG als auch IgA, untersucht.
Das Enzym Superoxiddismutase (SOD) bietet wegen seiner hohen Reaktionsrate und seiner extrem hohen Substratspezifi tät große Vorteile für eine Anwendung als Superoxidbiosensor. In dieser Arbeit wurden durch molekularbiologische Methoden Mutanten der humanen Cu,Zn-SOD gewonnen, welche ein oder zwei zusätzliche Cystein-Reste enthielten, die eine einfache Immobilisierung des Proteins durch Bindung des Cystein-Schwefels auf Goldelektroden ermöglichten. Sechs solcher Mutanten wurden entworfen, exprimiert, aufgereinigt und elektrochemisch charakterisiert. Alle Mutanten konnten durch einen einfachen Inkubationsschritt auf Goldelektroden gebunden werden und zeigten ein quasi-reversibles elektrochemisches Ansprechen. Für eine Mutante wurde die Anwendung als Superoxidsensor genauer untersucht und für beide Teilreaktionen der Dismutation ein Ansprechen des Sensors auf das Radikal gefunden. Bei Verwendung einer Teilreaktion konnte die Empfindlichkeit herkömmlicher Monoschichtsensoren um etwa eine Größenordnung übertroffen werden.