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Characterization, regulation and genetic modification of the synthesis of aroma compounds in non-conventional wine yeasts

Charakterisierung, Regulation und genetische Modifikation der Synthese von Aromastoffen in nicht-konventionellen Weinhefen

  • Yeasts belonging to the genus of Hanseniaspora are widespread in nature and are generally part of the microbiome of ripe fruits, such as apples, pears and grapes. Hanseniaspora spp. form 50-75% of the microorganisms found at the onset of grape must fermentations, H. uvarum often being the most abundant. H. uvarum is also a common isolate from other fruits, such as oranges, pineapples, mangoes, apples and pears. Since H. uvarum, known for producing high amounts of acetic acid and ethyl acetate,Yeasts belonging to the genus of Hanseniaspora are widespread in nature and are generally part of the microbiome of ripe fruits, such as apples, pears and grapes. Hanseniaspora spp. form 50-75% of the microorganisms found at the onset of grape must fermentations, H. uvarum often being the most abundant. H. uvarum is also a common isolate from other fruits, such as oranges, pineapples, mangoes, apples and pears. Since H. uvarum, known for producing high amounts of acetic acid and ethyl acetate, dominates the onset of spontaneous grape must fermentations, it greatly influences the aroma profile of wines. Besides its important role in fermentations, more biotechnological research has been reported in recent years, highlighting the universal value of H. uvarum beyond the beverage industry. In this thesis, I characterized the aroma-production profile of seven different Hanseniaspora spp. in simultaneous co-fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Significant differences could be detected between fermentations using Hanseniaspora spp. belonging to the fast-evolving lineage (FEL) and the slow-evolving lineage (SEL). Fermentations with yeasts of FEL showed increased amounts of ethyl acetate, whereas yeasts belonging to SEL revealed no meaningful difference compared to the pure S. cerevisiae fermentation. Furthermore, co-fermentations resulted in lactic acid depletion (H. osmophila), extremely high isoamyl acetate levels (H. guilliermondii), reduction in glycerol (H. occidentalis), increased terpenols (H. opuntiae) as well as esterified terpenes (H. guilliermondii and H. uvarum). This is the first study to investigate the use of H. nectarophila and H. meyerii in relation to wine, of which fermentations using H. nectarophila revealed high levels of acetate esters. Nitrogen sources in form of amino acids have a major impact on the resulting aroma-production profile of yeasts as they serve as backbones for several volatile organic compounds. I explored amino acid uptake preferences of Hanseniaspora spp. of both lineages (H. uvarum = FEL; H. osmophila = SEL), S. cerevisiae (all glucophilic), as well as the fructophilic yeasts Starmerella bacillaris and Zygosaccharomyces rouxii in synthetic must, spiked with single amino acids. Among yeasts investigated, H. uvarum showed the most rapid amino acid uptake. Additional research on yeast fermentations with synthetic must supplemented with an amino acid mix resulted in amino acid-dependent synthesis of specific aroma compounds by the respective yeast. This study reveals similarities in both preferences in amino acid uptake and nitrogen source depending aroma compound synthesis of H. osmophila and S. cerevisiae. I investigated the transcriptomic profile of H. uvarum and S. cerevisiae to gain insight into the different regulation mechanisms involved in the synthesis of aroma compounds. Furthermore, I explored the impact of different levels of nitrogen (nitrogen deficiency/ diammonium hydrogen phosphate (DAHP) supplemented must) within the grape must on the gene expression profile and therefore on the resulting aroma profile. Even though the different nitrogen regimes did not significantly affect transcriptional levels, a major impact on both fermentation kinetics and the aroma profile could be monitored. H. uvarum unravelled possessing additional genes including alcohol acetyltransferase activity leading to a rapid esterification of higher alcohols to acetate esters. In addition, the lack of genes involved in the synthesis of higher alcohols and ethyl esters, as well as an up-regulation of genes responsible for the synthesis of acetyl-coA and acetate esters favour the high acetate ester production. In this study, I developed the first genetic modification tool for H. uvarum by constructing a synthetic marker gene encoding the hygromycin marker under the control of a H. uvarum promoter, flanked by ~1 000 bp homology region to the target locus, enabling the knock-out of one copy of the alcohol acetyltransferase 1 (ATF1) gene. By increasing the concentration of the antibiotic during selection, I could identify a knock-out of both ATF1 alleles in the diploid yeast, generating a homozygotic atf1 mutant. Fermentations resulted in a significant reduction of the acetate ester synthesis, proving the function of ATF1 as an important gene involved in the ester synthesis in H. uvarum. Genetic modification of H. uvarum was optimized by establishing a rapid PCR-based gene targeting approach for one-step gene replacement. Generation of two novel synthetic antibiotic resistance genes (pFA-hygXL and pFA-clnXL) provided resistance against hygromycin and nourseothricin, respectively. Short flanking-homology regions of 56-80 bp added to these selection markers via PCR enabled gene targeting and the deletion of both the H. uvarum LEU2 and LYS2 genes via two rounds of consecutive transformations, generating a leucine auxotrophic leu2/leu2 mutant and a lysine auxotrophic lys2/lys2 mutant, respectively. The genetic modification approach of H. uvarum using PCR-based gene targeting was further validated by targeted complementation of the auxotrophic leu2/leu2 strain.show moreshow less
  • Hefen der Gattung Hanseniaspora sind in der Natur weit verbreitet und gehören im Allgemeinen zum Mikrobiom von reifen Früchten wie Äpfeln, Birnen und Trauben. Hanseniaspora spp. machen 50-75% der Mikroorganismen aus, die zu Beginn der Gärung von Traubenmost gefunden werden, wobei H. uvarum oft am häufigsten vorkommt. H. uvarum ist auch ein häufiges Isolat aus anderen Früchten, wie Orangen, Ananas, Mangos, Äpfeln und Birnen. Da H. uvarum, bekannt für die Herstellung großer Mengen an EssigsäureHefen der Gattung Hanseniaspora sind in der Natur weit verbreitet und gehören im Allgemeinen zum Mikrobiom von reifen Früchten wie Äpfeln, Birnen und Trauben. Hanseniaspora spp. machen 50-75% der Mikroorganismen aus, die zu Beginn der Gärung von Traubenmost gefunden werden, wobei H. uvarum oft am häufigsten vorkommt. H. uvarum ist auch ein häufiges Isolat aus anderen Früchten, wie Orangen, Ananas, Mangos, Äpfeln und Birnen. Da H. uvarum, bekannt für die Herstellung großer Mengen an Essigsäure und Ethylacetat, den Beginn der spontanen Gärung von Traubenmost dominiert, haben sie großen Einfluss auf das Aromaprofil von Weinen. Neben ihrer wichtigen Rolle bei der Gärung wurde in den letzten Jahren auch über weitere biotechnologische Forschungen berichtet, die den universellen Wert von H. uvarum über die Getränkeindustrie hinaus unterstreichen. In dieser Arbeit habe ich das Profil der Aromaproduktion von sieben verschiedenen Hanseniaspora spp. in simultanen Co-Fermentationen mit Saccharomyces cerevisiae charakterisiert. Es konnten signifikante Unterschiede zwischen Gärungen mit Hanseniaspora spp. der sich schnell entwickelnden Linie (FEL) und der sich langsam entwickelnden Linie (SEL) festgestellt werden. Gärungen mit Hefen der FEL zeigten erhöhte Mengen an Ethylacetat, während Hefen der SEL keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur reinen S. cerevisiae-Fermentation aufwiesen. Darüber hinaus führten Co-Fermentationen zu einem Abbau von Milchsäure (H. osmophila), zu extrem hohen Isoamylacetatwerten (H. guilliermondii), zu einer Verringerung des Glycerins (H. occidentalis), zu erhöhten Konzentration von Terpenolen (H. opuntiae) sowie zu veresterten Terpenen (H. guilliermondii und H. uvarum). Dies ist die erste Studie, in der die Verwendung von H. nectarophila und H. meyerii im Zusammenhang mit Wein untersucht wird, wobei bei der Gärung mit H. nectarophila ein hoher Gehalt an Acetatestern festgestellt wurde. Stickstoffquellen in Form von Aminosäuren haben einen großen Einfluss auf das resultierende Aromaprofil von Hefen, da sie als Grundgerüst für mehrere flüchtige organische Verbindungen dienen. Ich untersuchte die Aminosäureaufnahmepräferenzen von Hanseniaspora spp. beider Linien (H. uvarum = FEL; H. osmophila = SEL), S. cerevisiae (alle glucophil) sowie der fructophilen Hefen Starmerella bacillaris und Zygosaccharomyces rouxii in synthetischem Most, der mit einzelnen Aminosäuren versetzt war. Von den untersuchten Hefen nahm H. uvarum die Aminosäuren am schnellsten auf. Weitere Untersuchungen von Hefegärungen mit synthetischem Most, dem ein Aminosäuremix zugesetzt wurde, ergaben eine aminosäureabhängige Synthese von spezifischen Aromastoffen durch die jeweilige Hefe. Diese Studie zeigt Ähnlichkeiten sowohl in den Präferenzen bei der Aminosäureaufnahme als auch bei der von der Stickstoffquelle abhängigen Synthese von Aromastoffen bei H. osmophila und S. cerevisiae. Ich untersuchte das Transkriptionsprofil von H. uvarum und S. cerevisiae, um Einblicke in die unterschiedlichen Regulierungsmechanismen bei der Synthese von Aromastoffen zu gewinnen. Darüber hinaus untersuchte ich die Auswirkungen unterschiedlicher Stickstoffgehalte (Stickstoffmangel/ mit Diammoniumhydrogenphosphat (DAHP) angereicherter Most) im Traubenmost auf das Genexpressionsprofil und damit auf das resultierende Aromaprofil. Obwohl die verschiedenen Stickstoffregime keinen signifikanten Einfluss auf die Transkriptionslevel hatten, konnte ein wesentlicher Einfluss sowohl auf die Fermentationskinetik als auch auf das Aromaprofil beobachtet werden. H. uvarum erwies sich als Träger zusätzlicher Gene, die eine Alkohol-Acetyltransferase-Aktivität aufweisen, welche eine schnelle Veresterung höherer Alkohole zu Acetatestern ermöglicht. Darüber hinaus begünstigt das Fehlen von Genen, die an der Synthese höherer Alkohole und Ethylester beteiligt sind, sowie eine Hochregulierung von Genen, die für die Synthese von Acetyl-CoA und Acetatestern verantwortlich sind, die hohe Acetatester-Produktion. In dieser Studie habe ich das erste Werkzeug zur genetischen Veränderung von H. uvarum entwickelt, indem ich ein synthetisches Marker Gen konstruiert habe, welches für den Hygromycin-Marker unter der Kontrolle eines H. uvarum-Promotors kodiert, der von einer ~1 000 bp großen Homologie Region zum Ziellokus flankiert wird und den Knock-out einer Kopie des Alkohol Acetyltransferase 1 (ATF1)-Gens ermöglicht. Durch die Erhöhung der Antibiotikakonzentration während der Selektion konnte ich einen Knock-out beider ATF1-Allele in der diploiden Hefe identifizieren, wodurch eine homozygote atf1-Mutante entstand. Die Fermentationen führten zu einer deutlichen Verringerung der Acetatester-Synthese, was die Funktion von ATF1 als wichtiges Gen für die Ester-Synthese in H. uvarum beweist. Die genetische Veränderung von H. uvarum wurde durch die Einführung eines schnellen PCR-basierten Gen-Targeting-Ansatzes für den Genaustausch in einem Schritt optimiert. Die Generierung von zwei neuen synthetischen Antibiotikaresistenzgenen (pFA-hygXL und pFA-clnXL) ermöglichte die Resistenz gegen Hygromycin bzw. Nourseothricin. Kurze flankierende Homologie Regionen von 56-80 bp, die mittels PCR an diese Selektionsmarker angefügt wurden, ermöglichten das Gen-Targeting und die Deletion der beiden H. uvarum-Gene LEU2 und LYS2 durch zwei aufeinanderfolgende Transformationen, wodurch eine Leucin- bzw. Lysin-auxotrophe Mutante entstand. Der Ansatz zur genetischen Veränderung von H. uvarum mittels PCR-basiertem Gen-Targeting wurde durch gezielte Komplementierung des auxotrophen leu2/leu2-Stammes validiert.show moreshow less

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Metadaten
Author:Jennifer BaduraORCiD
URN:urn:nbn:de:hebis:2083-809
Publisher:Hochschule Geisenheim University
Place of publication:Geisenheim
Referee:Christian von Wallbrunn, Martin Rühl, Diethard Mattanovich
Advisor:Christian von Wallbrunn, Martin Rühl
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2024
Publishing Institution:Hochschule Geisenheim University
Granting Institution:Hochschule Geisenheim University
Granting Institution:Justus-Liebig-Universität Gießen
Date of final exam:2024/01/18
Release Date:2024/03/28
Volume:2024
Edition:1. Auflage
Page Number:226
First Page:II
Last Page:223
Note:
At the time of submission, the manuscript in Chapter 6 has been submitted to a peer-reviewed journal and has since been accepted for publication: https://academic.oup.com/femsyr/article/doi/10.1093/femsyr/foad034/7232499?login=true
Note:
Diese Promotion wurde im Rahmen eines gemeinsam betreuten Promotionsverfahrens in Zusammenarbeit mit dem Fachbereich 08 der Justus-Liebig-Universität über die Promotionsplattform Geisenheim, Gießen, Marburg durchgeführt.
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 50 Naturwissenschaften / 500 Naturwissenschaften und Mathematik
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