570 Biowissenschaften; Biologie
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Die funktionale Kopplung von photoaktiven Nanostrukturen mit Enzymen stellt eine neue Strategie zum Aufbau lichtgesteuerter biohybrider Systeme dar. Hier sind Untersuchungen zusammengefasst, welche die effiziente Kontaktierung der FAD-abhängigen Glukosedehydrogenase (FAD-GDH) mit Hilfe eines Osmium-Redoxpolymers (P Os ) an PbS-Quantum Dots (PbS QDs) zeigen, welche direkt auf dreidimensionalen TiO 2 -Elektrodenstrukturen synthetisiert wurden. Diese biohybriden Strukturen erlauben die Licht-induzierte Oxidation von Glukose. Dazu wird zunächst ein Verfahren vorgestellt, bei welchem durch den Aufbau invers-opaler TiO 2 (IO-TiO 2 ) Strukturen hohe Bindungskapazitäten für die Integration von QDs, Redoxpolymer und Enzym erreicht werden. In Folge wird gezeigt wie elektrochemische Signalketten durch Licht gesteuert werden können, indem Ladungsträger in den QDs unter Beleuchtung erzeugt werden. Diese Aktivierung ermöglicht dann die Ausbildung einer Elektrontransferkaskade vom Enzym über das Redoxpolymer zu den QDs und final zur IO-TiO 2 -Elektrode. Die resultierenden anodischen Photoströme können durch das Potential, die Lichtintensität und die Glukosekonzentration moduliert werden. So können in Anwesenheit von Glukose Photoströme von bis zu 207 μA/cm2 und erste Oxidationssignale bereits bei einem Potential von -540 mV vs Ag/AgCl, 1 M KCl erhalten werden. Dies entspricht einem Potentialgewinn von über 500 mV im Vergleich zu nicht lichtsensitiven Elektroden. Das vorgestellte biohybride System kombiniert Vorteile einer großen Oberfläche (durch IO-TiO 2 -Struktur), die effiziente Ladungsträgergenerierung und -trennung an der QD/TiO 2 -Schnittstelle sowie die effiziente Kontaktierung von FAD-GDH mit den QDs mit Hilfe eines Redoxpolymers. Die Ergebnisse verdeutlichen das Potential dieser leistungsfähigen Photobioanode für die Sensorik und die Erzeugung von Energie aus Licht und Glukose.
Die Kombination von fortschrittlichen Materialien und kontrolliertem Oberflächendesign mit komplexen Proteinen aus der natürlichen Photosynthese ist derzeit eines der Hauptthemen bei der Entwicklung von Biohybridsystemen und Biophotovoltaik. In dieser Studie werden transparente makroporöse Indium-Zinn-Oxid-(μITO-) Elektroden mit dem trimeren Superkomplex Photosystem I (PSI) aus dem Cyanobakterium Thermosynechococcus elongatus sowie dem kleinen Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c) kombiniert, um neuartige und effiziente biohybride Photokathoden herzustellen. Mit diesen bis zu 40 μm hohen 3D-Strukturen können beide Proteine in einer annähernden Monolage abgeschieden werden und die elektrische Kommunikation mit der Elektrode kann erzielt werden. Der generierte Photostrom folgt dabei linear der kontrollierbaren Schichtdicke der μITO-Elektrode, wobei
Stromdichten von bis zu 150 μA cm –2 erhalten werden. Eine effiziente elektrische Kopplung der Proteine kann durch die hohe interne Quanteneffizienz von 30 % gezeigt werden.
Die Flavin-abhängige Fruktosedehydrogenase und Cytochrom c: Elektronentransfer und Sensorstrategien
(2017)
Die hier durchgeführten Untersuchungen ermöglichen ein besseres Verständnis der Elektronentransferprozesse zwischen der Flavin-abhängigen Fruktosedehydrogenase (FDH) und dem Redoxprotein Cytochrom c (Cyt c). Dies liefert im Hinblick auf sensorische Anwendungen wichtige Erkenntnisse für vorteilhafte Sensorarchitekturen und deren Messbedingungen. Es wurden zwei unterschiedliche pH-Optima für die Redoxreaktion der beiden Proteine untereinander entdeckt. Die Reaktion wurde im Weiteren mit Elektroden kombiniert und so eine Fruktose-abhängige Stromantwort detektiert. Darüber hinaus konnten definierte dreidimensionale Sensorarchitekturen der beiden Proteine, mit Hilfe von DNA als zusätzlichen biologischen Baustein erzeugt und für die Sensorik genutzt werden.
Es wurde ein dreidimensionales Polymerfasernetzwerk aufgebaut, charakterisiert und anschließend daran das Enzym Pyrrolochinolinchinon-abhängige Glukosedehydrogenase (PQQ)GDH gebunden. Das Polymerfasernetzwerk wurde durch Elektrospinnen einer Mischung des Polymers Polyacrylnitril und verschiedener leitfähiger Polymere der Polyanilin-Familie auf Indium-Zinn-Oxid-Elektroden aufgebracht. Die so hergestellten Fasermatten erwiesen sich bei mikroskopischen Untersuchungen gleichförmig präpariert und die Faserdurchmesser bewegten sich im Bereich weniger hundert Nanometer. Das Redoxpaar Kaliumhexacyanoferrat (II/III) zeigte an diesen Polymer-Elektrodenstrukturen eine quasi-reversible Elektrochemie. Bei weitergehenden Untersuchungen an den enzymmodifizierten Fasern ((PQQ)GDH) konnten unter Substratzugabe (Glukose) bioelektrokatalytische Ströme nachgewiesen werden. Das Fasernetzwerk fungiert hier nicht nur als Immobilisierungsmatrix, sondern als auch als Teil des Signalwandlers.
Diese Studie beschreibt einen labelfreien impedimetrischen Sensor auf der Grundlage von kurzen einzelsträngigen DNA-Erkennungselementen für den Nachweis von Hybridisierungsereignissen. Der Fokus der Arbeit liegt auf der Aufklärung des Einflusses der Ziel-DNA-Länge und der Erkennungssequenzposition auf die sensorische Leistungsfähigkeit. Die impedimetrischen Messungen werden in Anwesenheit des Redoxsystems Kaliumhexacyanoferrat (II/III) durchgeführt und zeigen einen Anstieg des Durchtrittswiderstandes nach der Hybridisierung mit komplementärer Ziel-DNA mit einer Nachweisgrenze im unteren nanomolaren Bereich. Nach der Hybridisierung kann die Regeneration des Sensors mit deionisiertem Wasser durch die Einstellung effektiver Konvektionsbedingungen erreicht werden und ermöglicht somit eine Wiederverwendbarkeit des Sensors. Untersuchungen zu längeren Ziel-DNA-Strängen mit einem zur Lösung exponierten Überhang demonstrieren die Anwendbarkeit des impedimetrischen Nachweises für längere Sequenzen. Allerdings resultiert eine zunehmende Überhanglänge in einer verringerten Durchtrittswiderstandsänderung. Um die Impedanzänderung für längere Ziel-DNA zu erhöhen, wird die Erkennungssequenzposition verändert, sodass ein kleiner Überhang zur Elektrode ausgerichtet ist. Die Ergebnisse legen nahe, dass DNA in direkter Nähe zur Elektrode einen größeren Einfluss auf das impedimetrische Signal besitzt als weiter entfernte DNA.
Unter Verwendung von mehrwandigen Kohlenstoffnanoröhren wurde in dieser Studie eine neuartige Anode zum Einsatz in Biobrennstoffzellen entwickelt. Dazu wurde das rekombinante Enzym Pyrrolochinolinchinon(PQQ)- abhängige Glucosedehydrogenase kovalent an eine aus PQQ bestehenden Zwischenschicht gekoppelt, welche zuvor an die Kohlenstoffnanoröhren adsorbiert war. Die Nanoröhren wurden aufgrund ihrer Thiolmodifikation chemisorptiv auf einer Goldelektrode gebunden. In glucosehaltiger Lösung konnte der Start eines katalytischen Stroms bei einem Potential von -80 mV vs. Ag/AgCl (1 MKCl) beobachtet werden. Unter Substratsättigung wurden Stromdichten im Bereich von 170 bis 200 μA/cm2 gemessen. Dieses System basiert auf einem mediatorvermittelten Elektronentransfer. Die entwickelte (PQQ)-GDH-MWCNT-Elektrode wurde mit einer MWCNT-modifizierten Elektrode kombiniert, bei der Bilirubinoxidase (BOD) als Biokatalysator fungiert. Daraus resultierte eine membranfreie Biobrennstoffzelle mit einem leichgewichtspotential von 600 mV und Leistungsdichten im Bereich von 20-25 μW/cm2.
Entwicklung eines impedimetrischen Biosensors für den Nachweis von Antigliadin Autoantikörpern
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Biosensor für den Nachweis von Antikörpern gegen Gliadin entwickelt. Gliadine sind Bestandteile der Getreideglutene und verantwortlich für die Manifestation der Zöliakie (Gluten-Unverträglichkeit). Der Biosensor basiert auf der Immobilisierung von Gliadin auf Goldelektroden, die zuvor mit Polystyrensulfonsäure beschichtet worden waren. Die erfolgreiche Immobilisierung wurde mit Hilfe der Quarzmikrowaage dokumentiert. Die Antigen-Antikörper-Bindung konnte durch die Inkubation mit einem Peroxidase-markierten Zweitantikörper und der enzymatischen Oxidation von 3-Amino-9- Ethylcarbazol (AEC) verstärkt werden. Die Zunahme in der Elektrodenisolierung durch die Bindungs- und Ablagerungsreaktion konnte durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) in Anwesenheit des Hexacyanoferrat- Redoxsystems gemessen werden. Die Spektren wurden mit Hilfe eines Randles-Ersatzschaltbildes ausgewertet. Hierbei konnte eine Zunahme im Ladungstransferwiderstand festgestellt werden, die pro portional zur Antigliadin-Antikörperkonzentration, im Bereich von 10-8 M bis 10-6 M, war. Mit Hilfe dieses Sensors wurden schließlich humane Seren hinsichtlich ihrer Konzentration an Gliadinantikörpern, sowohl für Immunglobuline vom Typ IgG als auch IgA, untersucht.
Das Enzym Superoxiddismutase (SOD) bietet wegen seiner hohen Reaktionsrate und seiner extrem hohen Substratspezifi tät große Vorteile für eine Anwendung als Superoxidbiosensor. In dieser Arbeit wurden durch molekularbiologische Methoden Mutanten der humanen Cu,Zn-SOD gewonnen, welche ein oder zwei zusätzliche Cystein-Reste enthielten, die eine einfache Immobilisierung des Proteins durch Bindung des Cystein-Schwefels auf Goldelektroden ermöglichten. Sechs solcher Mutanten wurden entworfen, exprimiert, aufgereinigt und elektrochemisch charakterisiert. Alle Mutanten konnten durch einen einfachen Inkubationsschritt auf Goldelektroden gebunden werden und zeigten ein quasi-reversibles elektrochemisches Ansprechen. Für eine Mutante wurde die Anwendung als Superoxidsensor genauer untersucht und für beide Teilreaktionen der Dismutation ein Ansprechen des Sensors auf das Radikal gefunden. Bei Verwendung einer Teilreaktion konnte die Empfindlichkeit herkömmlicher Monoschichtsensoren um etwa eine Größenordnung übertroffen werden.