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Die Kontamination von Flächen mit Rüstungsaltlasten durch sprengstofftypische Verbindungen (STV) wie 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT) ist nach wie vor ein großes Risiko für Gesundheit und Umwelt. Die Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) ist in Kombination mit der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ein besonders sensitives und exaktes Verfahren zur Konzentrationsbestimmung derartiger Umweltkontaminanten. Jedoch benötigen die derzeit eingesetzten Methoden zur Extraktion und Quantifizierung viel Zeit und Bodenmaterial. Wir haben daher eine 20-minütige LC-MS/MS-Methode entwickelt, die in einer Probe simultan acht STV qualitativ und quantitativ nachweisen kann. Im Vergleich zur EPA-Referenzmethode konnte bei der Extraktion die eingesetzte Bodenmenge von 10 g auf 2 g reduziert und die Extraktionsdauer von 18 h auf 30 min verkürzt werden. Die abschließende Validierung zeigte eine gute Reproduzierbarkeit und mit etablierten Protokollen vergleichbare Detektions- (LOD) und Quantifizierungslimits (LOQ), so dass die optimierten Methoden für eine schnelle und zuverlässige Analyse von Realproben eingesetzt werden konnten.
Kaffee ist das wohl populärste Heißgetränk weltweit. Zwei botanische Arten sind für den Weltmarkt von Bedeutung und unterscheiden sich bezüglich ihres Anbaugebietes und der Inhaltsstoffe. Kaffee enthält über 850 bisher identifizierte Aromastoffe, welche den Geschmack bilden. Außerdem haben die Prozessierung der geernteten Kirsche bis zur Bohne, das Röstprofil und das Aufbrühen einen großen Einfluss darauf. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung der Prozessierungsmethode auf ausgewählte Inhaltsstoffe mit Hilfe der Flüsssig-Chromatographie-Tandem-Massenspektroskopie (LC-MS/MS) untersucht. Dafür wurden drei Prozessierungsmethoden, die unterschiedlich viel Wasser für das Ablösen des Fruchtfleisches von den Kaffeekirschen benötigen, und zwei Kultursorten miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigten einen geringfügig höheren Gehalt der zwei wichtigsten Inhaltsstoffe Koffein und Chlorogensäure in den Bohnen, bei deren Prozessierung im Eco-Pulper-Verfahren weniger Wasser eingesetzt wurde. Bis auf einen verringerten Gehalt an Saccharose wurde für weitere wichtige Inhaltsstoffe (Acrylamid, Niacin, Zitronensäure und Vanillin) kein signifikanter Unterschied bei höherem Wassereinsatz gefunden. Insofern man die untersuchten Inhaltsstoffe als Qualitätsmarker betrachtet, ist im Vergleich zu den anderen Prozessierungsmethoden das Eco-Pulper-Verfahren die beste Wahl, insbesondere da es als wassersparende Methode einen entscheidenden Beitrag zur Nachhaltigkeit des Kaffeeanbaus leistet.
Störungen im Metabolismus des Wachstumshormons können sich als Wachstumshormonmangel oder -überschuss (Akromegalie) äußern. In beiden Fällen handelt es sich um seltene Krankheiten, die aufwendig behandelt werden müssen, da jeder Patient anders auf seine jeweilige Medikation anspricht. Zur Bestimmung des individuellen Ansprechverhaltens auf die medikamentöse Behandlung wird Insulin-like Growth Factor 1 verwendet, das jedoch als unzuverlässig für die Therapiekontrolle gilt. Um die Diagnostik und Therapie von Wachstumshormonstörungen zu verbessern, wurde in dieser Pilotstudie der Nutzen des neuen potenziellen Biomarkers Elongin B/C-Cullin5-Socs-box Komplex (ECS-Komplex) überprüft. Die fünf Proteine des Komplexes üben zusammen einen negativen Feedback-Mechanismus auf den Wachstumshormonrezeptor aus und regulieren ihn in Abhängigkeit vom Wachstumshormonspiegel im Blut. Für diese Pilotstudie wurden vier Patienten mit Wachstumshormondefizienz und 15 Patienten mit Akromegalie rekrutiert. Die Messung von Unterschieden in der Expression der Gene auf RNA-Ebene in Blutproben der Patienten erlaubt erste Aussagen über deren Eignung als therapeutische Marker für diese Krankheiten.
Für den simultanen Nachweis mehrerer Analyten innerhalb einer Probe ist die Bead-basierte Multiplexanalytik ein häufig verwendetes Verfahren und wird beispielsweise zur Quantifizierung von Proteinen genutzt. Die aufwendige Durchführung der Assays soll durch Automatisierung einerseits dem Anwender abgenommen werden, während andererseits die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Analyse gesteigert wird. Die Automatisierung des Bio-Plex Pro™ Assays ist mit dem Pipettierroboter Tecan Freedom EVO 200 umgesetzt worden. Es ist ein Skript mit der Software Freedom EVOware® entwickelt worden, welches die Probenvorbereitung des Assays vollständig übernimmt. Für einen Vergleich der manuellen und automatisierten Methode sind die humanen Zytokine IL-2, IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-γ und TNF-α in einer achtstufigen Standardverdünnungsreihe und in unterschiedlich konzentrierten Proben gemessen worden. Die Berechnung der Streuungen (Standardabweichung und Variationskoeffizient) der einzelnen Standardverdünnungsreihen sowie der Vergleich von gemessenen und erwarteten Konzentrationen der automatisierten und manuellen Methode zeigen, dass die Automatisierung neben der zeitlichen Optimierung auch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Analyse verbessert.
Aus mitteleuropäischer Sicht ist die durch Parasiten verursachte und von Sandmücken übertragene Leishmaniose eine in Ländern tropischer und subtropischer Regionen
auftretende Infektionskrankheit. In zunehmendem Maße werden jedoch autochthone Fälle in Mitteleuropa, insbesondere in Süddeutschland, verzeichnet. Dies ist vermutlich auf die globale Erwärmung und die Ausdehnung des Verbreitungsgebietes der Sandmücken nach Norden zurückzuführen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Identifizierung und phylogenetischen Charakterisierung der Erreger dieser Fälle. Dazu wurden verschiedene Marker im Leishmaniengenom sequenziert und mit bekannten Arten verglichen. Die untersuchte DNA stammte von autochthonen kutanen Leishmaniosen bei Pferden und einem Rind, die in den letzten zehn Jahren in Deutschland und der Schweiz auftraten. Aufgrund identischer Sequenzen konnten die Parasiten als L. siamensis identifiziert bzw. verifiziert werden, eine erst im Jahr 2008 neu beschriebene Art, die in Thailand humane viszerale Leishmaniose verursacht. Die phylogenetischen Analysen zeigten die Ähnlichkeit von L. siamensis mit weiteren bisher nicht identifizierten Stämmen aus Martinique und Ghana, die kutane Leishmaniose bei Menschen verursachen. Um die Frage zu beantworten, ob sich die Leishmaniose zu einer in Mitteleuropa endemischen zoonotischen Krankheit entwickeln könnte, müssen weitere Studien über kompatible Vektoren, mögliche Reservoire und zur Virulenz durchgeführt werden.
Analyse komplexer biologischer Proben mittels oberflächenverstärkter Ramanspektroskopie (SERS)
(2014)
Diese Studie beschäftigt sich mit dem Nachweis biologischer Proben mit Hilfe der Raman-Mikroskopie. Um ausreichende Signalintensitäten auch bei niedrigen Konzentrationen zu erhalten, wurde insbesondere der Effekt der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (SERS) näher untersucht. Als Proben dienten DNA aus Hering-Sperma und das Protein Albumin. Zur Verstärkung des Raman-Spektrums wurden zwei unterschiedliche Methoden verwendet. Zum Einen wurden in einem chemischen Reduktionsprozess Nanosilberpartikel hergestellt und den biologischen Proben zugemischt. Zum Anderen wurden mit Hilfe laserangeregter periodischer Oberflächenstrukturierung (LIPSS) erzeugte nanostrukturierte Silberoberflächen als Substrate für die Proben verwendet. Diese Methode wurde bislang nicht für die SERS-Analyse biologischer Proben eingesetzt. Erste hier präsentierte Messungen zeigen, dass beide Verfahren signifikante SERS-Verstärkungen liefern und potentiell leistungsstarke Methoden für die zerstörungsfreie Analyse biologischer Proben darstellen.
Die medizinischen Blutegel, Hirudo medicinalis und Hirudo verbana, werden wegen ihrer kurativen Wirkung in der Humanmedizin angewandt. Während des Blutsaugens injizieren sie über ihren Speichel eine Vielzahl bioaktiver, derzeit noch unbekannter Moleküle. Eine vollständige Aufklärung aller Inhaltsstoffe mit Wirkmechanismen ist für die Entwicklung von neuen Pharmaka von großem Interesse. Vor diesem Hintergrund wurden verschiedene Organe beider Arten auf ihre Besiedlung durch symbiontische Bakterien untersucht. Dazu wurden die Bakterien zunächst unter geeigneten Bedingungen kultiviert und mittels biochemischer Methoden charakterisiert. Die Identifizierung der Symbionten erfolgte durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Sequenzierung der 16S rDNA. Die biochemischen Tests ergaben, dass die kultivierbaren Bakterien Amylase positiv, Gram negativ und Ornithin Decarboxylase negativ sind. Mit Hilfe von datenbankgestützten Analysen der 16S rDNA-Sequenzen konnte Aeromonas veronii biovar sobria nachgewiesen werden. Hochdurchsatzsequenzierungen der gesamtgenomischen DNA des Bakteriums aus H. medicinalis zeigten deutliche Abweichungen zum Referenzgenom von Aeromonas veronii B565.
Die Messung von Zytokinen in Stimulationsexperimenten zur Bestimmung von Stärke und Umfang einer Immunreaktion werden in der Praxis häufig an kryokonserviertem Zellmaterial durchgeführt. Bisherige Untersuchungen zum Einfluss der Kryokonservierung auf die Zytokinexpression sind widersprüchlich. In den hier durchgeführten Experimenten wurden die Genexpression und/ oder Sekretion der Zytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ und TNF-α in frisch isolierten und kryokonservierten Immunzellen aus Blut (PBMC) eines gesunden Spenders bestimmt. Diese wurden mit den Immunsystem-aktivierenden Stoffen OKT-3 und Concanavalin A (Con A) stimuliert und für 4 bzw. 24 h kultiviert. Ein Vergleich der frisch-isolierten und kryokonservierten PBMC in Stimulationsexperimenten zeigt, (1) dass die Messung der Genexpression genauere Einblicke zu Beginn der einsetzenden Immunreaktion verschafft, als die Messung der ausgeschütteten Zytokine, (2) dass durch Einfrieren die Immunreaktion insbesondere zu diesem Zeitpunkt beeinflusst wird und (3) dass zu späteren Zeitpunkten die Konzentrationsbestimmung der Zytokine im Zellkulturüberstand das Mittel der Wahl ist.
Etablierung von Hochdurchsatz-Kultivierungs- und -Screeningmethoden für phototrophe Einzeller
(2012)
Mit Hochdurchsatz-Kultivierungs- und -Screeningmethoden können viele Proben parallel, miniaturisiert und kostengünstig bearbeitet werden. Für phototrophe Organismen wie Mikroalgen und Cyanobakterien sind Hochdurchsatz-Kultivierungsverfahren jedoch bis heute kaum etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Verfahren beispielhaft für das Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert. Die benötigte technische Automatisierung wurde hierbei durch den Einsatz eines Tecan Genesis RSP 150 Pipettierroboters erreicht. Die Kultivierung erfolgte in Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kammer mit programmierbaren Schüttlern, einstellbarer Belichtung und CO2-Atmosphäre. Die in diesem System erreichten Wachstumsraten sind vergleichbar mit publizierten Kultivierungsmethoden. Das Hochdurchsatz-Screening wurde mit Hilfe eines in den Roboter integrierten Tecan Genios Plus Plattenreaders durchgeführt. Es wurden beispielhaft Methoden zur Bestimmung von optischer Dichte und Chlorophyllgehalt etabliert. Die hier vorgestellte Plattform kann vielseitig zur Analyse phototropher Organismen eingesetzt werden und ist durch entsprechende Assays leicht zur Messung anderer Parameter erweiterbar.
Detektion des Kartoffelspindelknollen Viroids mit Hilfe der Loop Mediated Isothermal Amplification
(2011)
PSTV ist ein hoch infektiöses Viroid, das in Kartoffeln verkleinerte und spindelähnliche Knollen verursacht. Um Ernteverlusten vorzubeugen, ist eine Detektion in frühen Infektionsstadien von großer Bedeutung. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität wird die PCR als Standardnachweisverfahren für PSTV verwendet. Nachteilig an dieser Methode sind der apparative Aufwand und die zeitaufwändige Durchführung. Als viel versprechende Alternative konnte der Nachweis von PSTV mit Hilfe der Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) gezeigt werden. Hierbei handelt es sich um eine einfache und schnelle Methode, für die wenig aufwändige Laborausrüstung benötigt wird. Dabei ermöglichte eine an den Amplifikationsprozess gekoppelte Fluoreszenzreaktion die Detektion von Produkten direkt nach der Nachweisreaktion mit dem bloßen Auge (bzw. unter UV-Licht). Die Ergebnisse konnten mit Hilfe einer Real Time Detektion des auftretenden Fluoreszenzsignals bestätigt werden.
Einführung eines Qualitätsmanagement-Systems in einem molekularbiologischen Labor einer Hochschule
(2010)
Zertifizierte Qualitätsmanagementsysteme (QM-Systeme) sind in akademischen Forschungslaboren bisher kaum vertreten. Hier ist vor allem die Bedeutung eines zertifizierten Labors vor dem Hintergrund der Veröffentlichung wissenschaftlicher Publikationen scheinbar bedeutungslos. Im industriellen Bereich hingegen sind QM-Systeme weitaus häufiger eingeführt. Labore im akademischen Bereich stehen jedoch grundsätzlich in der Verantwortung, schonend mit den Ressourcen des Staates umzugehen, und haben darüber hinaus das Bestreben, Forschungs-/Industrieaufträge einzuwerben. Mit dieser Publikation wird gezeigt, wie durch die Einrichtung eines QM-Systems und der Einhaltung der normativen Vorgabe ein verbesserter schonender Umgang mit staatlichen Ressourcen möglich ist, die Ergebnissicherheit erhöht, Betriebsabläufe optimiert, die Chancen für Studenten auf dem Arbeitsmarkt verbessert werden und mehr Forschungs-/Industrieaufträge akquiriert werden können. Es wird dargestellt, wie ein QM-System in einem Labor eingerichtet werden kann. Dabei wird erläutert, welche QM-Regelwerke für ein Labor im Hochschulbereich in Betracht kommen. Zudem wird eine Methodik in Form eines Projektplans vorgestellt, mit dem die Anforderungen der Norm strukturiert umgesetzt werden können. Das QM-System wurde im Labor für Molekularbiologie und Funktionelle Genomik an der Technischen Hochschule Wildau [FH] eingeführt und im Rahmen der Zertifizierung der Hochschule in das Audit einbezogen.
Die simultane Bestimmung mehrerer Analyten und die Erstellung komplexer Parameterprofi e erlangt immer größere Bedeutung in der heutigen Labordiagnostik. Die Bead-basierte Multiplexanalytik bietet hier eine flexible, schnelle und einfache Methode zur Erstellung individueller Analysen. Aufgrund der Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten, die diese moderne Nachweismethode im Bereich molekularbiologischer Fragestellungen bietet, ist die Etablierung der Beadbasierten Multiplexanalytik im Labor für Molekularbiologie und funktionelle Genomik der Technischen Hochschule Wildau von großem Nutzen. Zur Einarbeitung in das Testsystem wurden die Konzentrationen der Zytokine IL-2, IL-4, IFN-γ und TNF-α in Zellkulturüberständen mit kommerziellen Fertigsystemen gemessen und mit mRNA-Expressionsraten der gleichen Proben verglichen. Des Weiteren wurde ein Testsystem zum Nachweis von humanen Antikörpern der Klassen IgG und IgM sowie deren antigen-spezifischer Anteil in Zellkulturüberständen entwickelt. Außerdem konnte durch die erfolgreiche Detektion von DNA-gekoppelten Beads mittels markierter Oligonukleotidsequenz die Kopplung und die Anwendbarkeit der Methode auf Bindungsexperimente mit Nukleotidsequenzen gezeigt werden
Genomics technologies, especially transcriptional profiling, allows comparisons of gene expression within and across different organisms. By the use of the model group Tardigrada, also known as water bear, we try to understand the phenomenon of cryptobiosis. The dry organisms can survive for years without water. When re-exposed to water, the animals rehydrate and come back to life. The expression of genes in response to dehydratation and rehydratation is being examined in our laboratory through the generation of expressed sequence tags (ESTs), representational difference analysis (RDA) and subsequent microarray analysis. Molecular dissection of this complex phenomenom, including gene regulation, will allow the development of techniques for preservation and stabilisation of biological materials in a dried state.
Prostate cancer is one of the most common causes of death in men. In this work a siRNA screen of around 1500 cancer-relevant genes was performed using 3 different cell lines (VCaP, LAPC-4, RWPE-1). A novel technique, the living cell array, was initiated in order to obtain information about the biology of Androgeninduced growth in prostate tumour cell lines. This technique is based on the principal of reverse transfection [1] and genes are knocked down by siRNAs. The cells on the living cell array were set under stress by reduction of the androgens in the media while the proliferation and apoptosis were quantified. The statistical analysis of the data implicates the success of the screen and shows that this method is suitable for large-scale experiments.