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Etablierung von Hochdurchsatz-Kultivierungs- und -Screeningmethoden für phototrophe Einzeller
(2012)
Mit Hochdurchsatz-Kultivierungs- und -Screeningmethoden können viele Proben parallel, miniaturisiert und kostengünstig bearbeitet werden. Für phototrophe Organismen wie Mikroalgen und Cyanobakterien sind Hochdurchsatz-Kultivierungsverfahren jedoch bis heute kaum etabliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Verfahren beispielhaft für das Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert. Die benötigte technische Automatisierung wurde hierbei durch den Einsatz eines Tecan Genesis RSP 150 Pipettierroboters erreicht. Die Kultivierung erfolgte in Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kammer mit programmierbaren Schüttlern, einstellbarer Belichtung und CO2-Atmosphäre. Die in diesem System erreichten Wachstumsraten sind vergleichbar mit publizierten Kultivierungsmethoden. Das Hochdurchsatz-Screening wurde mit Hilfe eines in den Roboter integrierten Tecan Genios Plus Plattenreaders durchgeführt. Es wurden beispielhaft Methoden zur Bestimmung von optischer Dichte und Chlorophyllgehalt etabliert. Die hier vorgestellte Plattform kann vielseitig zur Analyse phototropher Organismen eingesetzt werden und ist durch entsprechende Assays leicht zur Messung anderer Parameter erweiterbar.
Die Messung von Zytokinen in Stimulationsexperimenten zur Bestimmung von Stärke und Umfang einer Immunreaktion werden in der Praxis häufig an kryokonserviertem Zellmaterial durchgeführt. Bisherige Untersuchungen zum Einfluss der Kryokonservierung auf die Zytokinexpression sind widersprüchlich. In den hier durchgeführten Experimenten wurden die Genexpression und/ oder Sekretion der Zytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ und TNF-α in frisch isolierten und kryokonservierten Immunzellen aus Blut (PBMC) eines gesunden Spenders bestimmt. Diese wurden mit den Immunsystem-aktivierenden Stoffen OKT-3 und Concanavalin A (Con A) stimuliert und für 4 bzw. 24 h kultiviert. Ein Vergleich der frisch-isolierten und kryokonservierten PBMC in Stimulationsexperimenten zeigt, (1) dass die Messung der Genexpression genauere Einblicke zu Beginn der einsetzenden Immunreaktion verschafft, als die Messung der ausgeschütteten Zytokine, (2) dass durch Einfrieren die Immunreaktion insbesondere zu diesem Zeitpunkt beeinflusst wird und (3) dass zu späteren Zeitpunkten die Konzentrationsbestimmung der Zytokine im Zellkulturüberstand das Mittel der Wahl ist.
Prostate cancer is one of the most common causes of death in men. In this work a siRNA screen of around 1500 cancer-relevant genes was performed using 3 different cell lines (VCaP, LAPC-4, RWPE-1). A novel technique, the living cell array, was initiated in order to obtain information about the biology of Androgeninduced growth in prostate tumour cell lines. This technique is based on the principal of reverse transfection [1] and genes are knocked down by siRNAs. The cells on the living cell array were set under stress by reduction of the androgens in the media while the proliferation and apoptosis were quantified. The statistical analysis of the data implicates the success of the screen and shows that this method is suitable for large-scale experiments.
Genomics technologies, especially transcriptional profiling, allows comparisons of gene expression within and across different organisms. By the use of the model group Tardigrada, also known as water bear, we try to understand the phenomenon of cryptobiosis. The dry organisms can survive for years without water. When re-exposed to water, the animals rehydrate and come back to life. The expression of genes in response to dehydratation and rehydratation is being examined in our laboratory through the generation of expressed sequence tags (ESTs), representational difference analysis (RDA) and subsequent microarray analysis. Molecular dissection of this complex phenomenom, including gene regulation, will allow the development of techniques for preservation and stabilisation of biological materials in a dried state.
Die simultane Bestimmung mehrerer Analyten und die Erstellung komplexer Parameterprofi e erlangt immer größere Bedeutung in der heutigen Labordiagnostik. Die Bead-basierte Multiplexanalytik bietet hier eine flexible, schnelle und einfache Methode zur Erstellung individueller Analysen. Aufgrund der Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten, die diese moderne Nachweismethode im Bereich molekularbiologischer Fragestellungen bietet, ist die Etablierung der Beadbasierten Multiplexanalytik im Labor für Molekularbiologie und funktionelle Genomik der Technischen Hochschule Wildau von großem Nutzen. Zur Einarbeitung in das Testsystem wurden die Konzentrationen der Zytokine IL-2, IL-4, IFN-γ und TNF-α in Zellkulturüberständen mit kommerziellen Fertigsystemen gemessen und mit mRNA-Expressionsraten der gleichen Proben verglichen. Des Weiteren wurde ein Testsystem zum Nachweis von humanen Antikörpern der Klassen IgG und IgM sowie deren antigen-spezifischer Anteil in Zellkulturüberständen entwickelt. Außerdem konnte durch die erfolgreiche Detektion von DNA-gekoppelten Beads mittels markierter Oligonukleotidsequenz die Kopplung und die Anwendbarkeit der Methode auf Bindungsexperimente mit Nukleotidsequenzen gezeigt werden
Einführung eines Qualitätsmanagement-Systems in einem molekularbiologischen Labor einer Hochschule
(2010)
Zertifizierte Qualitätsmanagementsysteme (QM-Systeme) sind in akademischen Forschungslaboren bisher kaum vertreten. Hier ist vor allem die Bedeutung eines zertifizierten Labors vor dem Hintergrund der Veröffentlichung wissenschaftlicher Publikationen scheinbar bedeutungslos. Im industriellen Bereich hingegen sind QM-Systeme weitaus häufiger eingeführt. Labore im akademischen Bereich stehen jedoch grundsätzlich in der Verantwortung, schonend mit den Ressourcen des Staates umzugehen, und haben darüber hinaus das Bestreben, Forschungs-/Industrieaufträge einzuwerben. Mit dieser Publikation wird gezeigt, wie durch die Einrichtung eines QM-Systems und der Einhaltung der normativen Vorgabe ein verbesserter schonender Umgang mit staatlichen Ressourcen möglich ist, die Ergebnissicherheit erhöht, Betriebsabläufe optimiert, die Chancen für Studenten auf dem Arbeitsmarkt verbessert werden und mehr Forschungs-/Industrieaufträge akquiriert werden können. Es wird dargestellt, wie ein QM-System in einem Labor eingerichtet werden kann. Dabei wird erläutert, welche QM-Regelwerke für ein Labor im Hochschulbereich in Betracht kommen. Zudem wird eine Methodik in Form eines Projektplans vorgestellt, mit dem die Anforderungen der Norm strukturiert umgesetzt werden können. Das QM-System wurde im Labor für Molekularbiologie und Funktionelle Genomik an der Technischen Hochschule Wildau [FH] eingeführt und im Rahmen der Zertifizierung der Hochschule in das Audit einbezogen.
Detektion des Kartoffelspindelknollen Viroids mit Hilfe der Loop Mediated Isothermal Amplification
(2011)
PSTV ist ein hoch infektiöses Viroid, das in Kartoffeln verkleinerte und spindelähnliche Knollen verursacht. Um Ernteverlusten vorzubeugen, ist eine Detektion in frühen Infektionsstadien von großer Bedeutung. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität wird die PCR als Standardnachweisverfahren für PSTV verwendet. Nachteilig an dieser Methode sind der apparative Aufwand und die zeitaufwändige Durchführung. Als viel versprechende Alternative konnte der Nachweis von PSTV mit Hilfe der Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) gezeigt werden. Hierbei handelt es sich um eine einfache und schnelle Methode, für die wenig aufwändige Laborausrüstung benötigt wird. Dabei ermöglichte eine an den Amplifikationsprozess gekoppelte Fluoreszenzreaktion die Detektion von Produkten direkt nach der Nachweisreaktion mit dem bloßen Auge (bzw. unter UV-Licht). Die Ergebnisse konnten mit Hilfe einer Real Time Detektion des auftretenden Fluoreszenzsignals bestätigt werden.
DNA sequencing continues to evolve quickly even after > 30 years. Many new platforms suddenly appeared and former established systems have vanished in almost the same manner. Since establishment of next-generation sequencing devices, this progress gains momentum due to the continually growing demand for higher throughput, lower costs and better quality of data. In consequence of this rapid development, standardized procedures and data formats as well as comprehensive quality management considerations are still scarce. Here, we listed and summarized current standardization efforts and quality management initiatives from companies, organizations and societies in form of published studies and ongoing projects. These comprise on the one hand quality documentation issues like technical notes, accreditation checklists and guidelines for validation of sequencing workflows. On the other hand, general standard proposals and quality metrics are developed and applied to the sequencing workflow steps with the main focus on upstream processes. Finally, certain standard developments for downstream pipeline data handling, processing and storage are discussed in brief. These standardization approaches represent a first basis for continuing work in order to prospectively implement next-generation sequencing in important areas such as clinical diagnostics, where reliable results and fast processing is crucial. Additionally, these efforts will exert a decisive influence on traceability and reproducibility of sequence data.
In this work we describe and test high-throughput methods with the model organism Synechocystis sp. PCC6803. The required technical automation for these processes was achieved with a Tecan Freedom Evo 200 pipetting robot. The cultivation was performed in 2.2 ml deepwell microtiter plates within a cultivation chamber outfitted with programmable shaking conditions, variable illumination, variable temperature, and an adjustable CO2 atmosphere. Each microtiter-well within the chamber functions as a separate cultivation vessel with reproducible conditions. The automated measurement of various parameters such as growth, full absorption spectrum, chlorophyll concentration, MALDI-TOF-MS, as well as a novel vitality measurement protocol, have already been established and can be monitored during cultivation. Measurement of growth parameters can be used as inputs for the system to allow for periodic automatic dilutions and therefore a semi-continuous cultivation of hundreds of cultures in parallel. The system also allows the automatic generation of mid and long term backups of cultures to repeat experiments or to retrieve strains of interest.
Temperature tolerance is an important aspect for commercial scale outdoor cultivation of microalgae and cyanobacteria. While various genes are known to be related to Synechocystis sp. PCC6803's heat shock response, there is very limited published data concerning the specific genes involved in long term thermal tolerance. We have previously used random mutagenesis and adaptive evolution to generate a mixture of strains of Synechocystis sp. PCC6803 with significantly increased thermal tolerance. The genetic modifications leading to the phenotypes of the newly generated strains are the focus of this work.