TY - THES A1 - Grebinyk, Anna T1 - Synergistic Chemo- and Photodynamic Treatment of Cancer Cells with C60 Fullerene Nanocomplexes N2 - Recent progress in nanotechnology has attracted interest to a biomedical application of the carbon nanoparticle C60 fullerene (C60) due to its unique structure and versatile biological activity. In the current study the dual functionality of C60 as a photosensitizer and a drug nanocarrier was exploited to improve the efficiency of chemotherapeutic drugs towards human leukemic cells. Pristine C60 demonstrated time-dependent accumulation with predominant mitochondrial localization in leukemic cells. C60’s effects on leukemic cells irradiated with high power single chip LEDs of different wavelengths were assessed to find out the most effective photoexcitation conditions. A C60-based noncovalent nanosized system as a carrier for an optimized drug delivery to the cells was evaluated in accordance to its physicochemical properties and toxic effects. Finally, nanomolar amounts of C60-drug nanocomplexes in 1:1 and 2:1 molar ratios were explored to improve the efficiency of cell treatment, complementing it with photodynamic approach. A proposed treatment strategy was developed for C60 nanocomplexes with the common chemotherapeutic drug Doxorubicin, whose intracellular accumulation and localization, cytotoxicity and mechanism of action were investigated. The developed strategy was revealed to be transferable to an alternative potent anticancer drug – the herbal alkaloid Berberine. Hereafter, a strong synergy of treatments arising from the combination of C60-mediated drug delivery and C60 photoexcitation was revealed. Presented data indicate that a combination of chemo- and photodynamic treatments with C60-drug nanoformulations could provide a promising synergetic approach for cancer treatment. KW - cancer KW - drug delivery KW - photodynamic therapy KW - fullerene Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14137 ER - TY - THES A1 - Arndt, Wulf-Holger T1 - Optimierungspotenziale im Wirtschaftsverkehr durch bestellerseitige Kooperation N2 - Es wird ein neuer Ansatz zur Verkehrs- und Kostenreduzierung im Wirtschaftsverkehr (genauer Lieferverkehr) untersucht. Die virtuelle Zusammenfassung von Bestellungen z.B. über eine Internet-/Intranetplattform - eine Empfänger/Bestellerkooperation kann möglicherweise zur Bündelung der Lieferverkehre führen. Aufgrund von neuen Produktionsmethoden und Managementstrategien zur Stärkung der Eigenverantwortlichkeit von Unternehmensbereichen und Abteilungen laufen Bestellprozesse oft separat und unkoordiniert ab. Eine Folge ist die Zersplitterung der Bestellungen und die geringe Auslastung von Lieferverkehren. Neben dieser Dezentralisierung führt „Outsourcen“ dazu, dass Bestellungen immer kleinteiliger und weniger zusammengefasst werden. Um trotzdem Kosten zu sparen versuchen Lieferanten Bündelungen durchzuführen. Dies geschieht bei Spedition am ehesten unternehmensintern aber auch in Netzwerken oder bei der City-Logistik auch überbetrieblich als Versenderkooperation. Dies ist aber nur die eine Seite des Beschaffungsprozesses. Außerdem ist der Versenderkooperation durch Konkurrenzsituationen Grenzen gesetzt. Auf der anderen Seite ist eine Bündelung (der Bestellungen) ebenfalls denkbar, wenn sich daraus Vorteile für die Besteller ergeben, z.B. Preisreduktionen aufgrund größerer Bestellmengen. Das wäre eine Besteller- bzw. Empfängerkooperation. Die Besteller/Empfänger schließen sich zusammen und nehmen durch die Bestellungsbündelung den Versendern und Transporteuren quasi die Abstimmungs-Probleme einer Kooperation untereinander teilweise ab. Werden Lieferprozesse mit in die Kooperation integriert, handelt es sich um eine Beschaffungs-kooperation. Früher war eine solche Bündelung auf Bestellerseite durch große bestellende Einheiten (Werksgröße, Zentralisierung, hohe Produktionstiefe,...) per se gegeben. Diese Produktions-methoden sind nicht einfach wieder herstellbar. Eine virtuelle Bündelung z.B. mittels E Procurement (u.a. Internet-Bestellplattform) wäre heute zeitgemäß. Diese realisiert quasi eine virtuelle Zentralbestellung innerbetrieblich für dezentral organisierte Strukturen oder überbetrieblich zwischen unabhängigen Unternehmen. Die hauptsächlichen Vorteile einer solchen Kooperation sind neben Prozessvereinfachung, Transparenzerhöhung sowie Verbesserung der Steuerung und Kontrolle bei der Beschaffung, Kosteneinsparung durch Aufwandsminimierung und Nutzung von Preisrabatten durch Bündelung der Bestellmengen von mehreren Bestellern. Im Wirtschaftsverkehr sind Effizienzsteigerung und Verkehrsreduzierung durch Kooperationen noch wenig untersucht. Insbesondere Planungsinstrumente zur Förderung solcher Kooperationen müssen entwickelt werden. Innerhalb dieser Arbeit fanden umfangreiche Erhebungen statt. In Felduntersuchungen an der Technische Universität Berlin, verschiedenen Gewerbegebieten, Handelseinrichtungen (Shop-in-Shop-Systemen) und Bürohäusern wurden Beschaffungsprozesse, Organisationsprobleme und Kooperationsneigungen analysiert. Auf Grundlage der Erkenntnisse aus diesen quantitativen Befragungen und zusätzlichen qualitativen Experteninterviews zur Beschaffung sind verschiedene Varianten des Ansatzes entwickelt worden. In einer abschließenden deutschlandweiten Online-Unternehmensbefragung mit 1.700 auswertbaren Antworten, einer Conjoint-Analyse und weiteren Experteninterviews wurden verkehrliche Wirkungen untersucht, Kooperationsansätze bewertet und weiter entwickelt. N2 - This Book introduce in an approach to reducing traffic and costs in commercial transport (delivery transport). The virtual summary of orders e.g. by an Internet/Intranet platform - a receiver/orderer cooperation- can possibly lead to the bundling of the delivery traffics. The demand of commercial transport (business and goods transport) has dramatically changed over the last years. Current trends in globalisation and the change of general conditions of trade, associated with changes in economic structures, play a central role. A few examples of effects important for commercial transport are the expansion and internationalisation of markets, a sharing of labour, which is both increasingly distance-intensive and geographically independent, higher requirements regarding the timing of goods provision and an increase of complexity in the logistics of providing supplies and services. Many of the accepted new logistics technologies lead to an increase in traffic. An increasing number of small-component products have to be transported more frequently over longer distances. Enterprises react on these changes and on increasing competition with reduction of costs in production and reproduction as well as with reducing of capital bond. These concepts of rationalisation include outsourcing, modular technologies, abolition of stores, or global sourcing for lowest purchasing prices. Logistic strategies such as ‘just in time delivery’ and ‘hub and spoke networks’ of freight forwarder may lead to an increase in trip frequency and to more commercial transport on roads. Mostly of the approaches to save cost in this situation are supplier and/or forwarding business cooperations, also known as city logistics. The past models of supplier cooperations have rather modest success. Competition and coordination problems are two of the reasons. By bundling of orders, however, the problematic coordination of deliver by of carrier agents could be avoided in the first place. E-procurement systems with internet/intranet platform may be use for order bundling leading. The whole approach would result in traffic and cost reduction. The research in the area of orderer/receiver or procurement cooperation is, however, still pending. For participating companies (or public institutions) a procurement cooperation has clear advantages: use of scale effects (price discounts) by higher order quantities, better order competence, more transparency (especially by use of e-procurement) and process cost savings in procurement. On the social level, the bundling of orders leads to higher vehicle load factor and traffic reduction. The research of orderer/receiver or procurement cooperation is, however, still pending. Especially planning instruments for promotion of cooperation have to be developed. The effects of procurement cooperation, impacts of concepts and planning instruments for promotion were analyzed in this book. For this investigation a combination of different surveys was developed: An Germany-wide online survey with 1.700 responders for basic company and procurement data as well as traffic impacts of the approach, a conjoint analysis to evaluate the preferences of types of procurement cooperation and expert interviews to analyse the procurement decisions and prerequisites for implementation of procurement cooperation. KW - Wirtschaftsverkehr KW - Verkehr KW - Beschaffung KW - Logistik KW - commercial transport Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-15497 ER - TY - THES A1 - Tanui, Josephat T1 - Detailed study of wood combustion in a fixed bed reactor under oxy-fuel condition N2 - Biomass fuel is the major source of energy for a significant proportion of the world population. Conventionally, biomass is burned in combustors that use air as oxidizer. The need for efficiency and reduced emissions has led to development of clean combustion technologies such as oxy-fuel combustion. In oxy-fuel combustion technique, fuel is burnt in O2/CO2 environment instead of O2/N2 environment. In spite of biomass being used under oxy-fuel conditions using fixed bed furnaces, there is no detailed study of biomass combustion in fixed bed reactors under oxy-fuel condition. The studies only cover combustion under air-fuel condition. There is no report in the literature on important combustion parameters, viz., flame propagation speed, temperature profiles, ignition time, and species evolution in the fixed bed combustion under oxy-fuel conditions; the studies have been only in air. This work extends the research on biomass conversion to combustion under oxy-fuel conditions. To address these knowledge gaps, this PhD thesis focused on establishing and isolating the role of various CO2 effects on biomass combustion properties using a laboratory fixed bed reactor through experiments and numerical modeling. The fixed bed reactor used in this study was operated in counter-current flame propagation mode. Oxidizer was a mixture of pure O2 and N2 or CO2. Measurement were made for air-fuel condition, oxy-fuel condition of different O2/CO2 mixtures and various initial bed porosity. In this work, all numerical simulations were carried out using a commercial CFD software CD-Adapco (STAR CCM+ version 11.04). Euler-Lagrange (CFD-DEM) approach was used to model biomass conversion in a packed bed. Solid particles and their conversion were modeled using DEM while fluid phase was modeled as a continuous phase using CFD. Biomass conversion was modeled by four sub-models, namely, drying, pyrolysis, gas-phase reactions and char oxidation models. These models were adopted and improved from previous research on wood combustion. To account for oxy-fuel combustion environment, reaction involving CO2 which has been identified as the dominant reaction pathway as well as its associated chain-branching reactions were incorporated in homogeneous reaction sub-model. In order to separate effects of CO2 on wood combustion, four different mixtures of O2 and Ar/CO2/N2 were designed and simulated. Temperature in O2/CO2 combustion environment was adjusted to be equal to that of O2/N2 environment by adding an appropriate amount of Ar while O2 amount remained the same. The results showed that flame front propagation speed in oxy-fuel atmosphere reduced to 78% of that of the air-fuel condition with similar O2 concentration. The CFD-DEM model agreed very well with experimental values for mass loss, propagation speed and flame front positions. However, peak temperatures were poorly predicted at lower oxygen concentrations. The accuracy of temperature prediction improved at higher oxygen concentrations. It was noted that oxy-fuel peak temperature is lower than air-fuel temperature by about 200 K. For oxy-fuel combustion, peak temperature value and propagation speed increases as O2 concentration is increased. The results showed that at any given oxygen concentration, ignition time in oxy-fuel environment is almost twice that of corresponding air-fuel condition. It was established that the packing density affects combustion process by changing the burning conditions and limits. Furthermore, the study revealed that there is an optimum packing density, χ = 0.71, beyond which the efficiency falls due to the onset of quenching in the spaces. It was concluded that dilution effect is the most influential parameter on the burning rate of wood combustion in an oxy-fuel system. In a future study, the model prediction could be improved by including ash inhibition sub-model and using a full chemical kinetic mechanism for hydro-carbon combustion. It was also recommended that a detail analysis of heat transfer in the bed could be investigated in a future study. The findings from this work are important and may be useful when designing burners which operate under oxy-fuel combustion conditions. Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-15320 ER - TY - THES A1 - Tillich, Ulrich M. T1 - Adaptive Evolution und Screening bei Cyanobakterien - Erzeugung und Untersuchung von Thermotoleranz in Synechocystis sp. PCC 6803 N2 - Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Temperaturtoleranz des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 mittels ungerichteter Mutagenese und adaptiver Evolution. Trotz des erneuten Interesses an Cyanobakterien und Mikroalgen in den letzten Jahren, gibt es nur relativ wenige aktuelle Studien zum Einsatz dieser Methoden an Cyanobakterien. Zur Analyse eines mittels Mutagenese erzeugten Gemischs an Stämmen, ist es von großem Vorteil Hochdurchsatz-Methoden zur Kultivierung und zum Screening einsetzen zu können. Auf Basis eines Pipettierroboters wurde solch eine Plattform für phototrophe Mikroorganismen neu entwickelt und folgend stetig verbessert. Die Kultivierung erfolgt in 2,2ml Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kultivierungskammer. Schüttelbedingungen, Beleuchtung, Temperatur und CO2-Atmosphäre sind hierbei vollständig einstellbar.Die Plattform erlaubt semi-kontinuierliche Kultivierungen mit automatisierten Verdünnungen von hunderten Kulturen gleichzeitig. Automatisierte Messungen des Wachstums, des Absorptionsspektrums, der Chlorophyllkonzentration, MALDI-TOF-MS sowie eines neu entwickelten Vitalitätsassays wurden etabliert. Für die Mutagenese wurden die Letalität- und die nicht-letale Punktmutationsrate von ultravioletter Strahlung und Methylmethansulfonat für Synechocystis charakterisiert. Synechocystis wurde mit den so ermittelten optimalen Dosen mehrfach behandelt und anschließend einer in vivo Selektion unterzogen. Somit wurde dessen Temperaturtoleranz um bis zu 3°C erhöht. Über die Screeningplattform wurden die thermotolerantesten monoklonalen Stämme identifiziert. Nach einer Validierung wurde das vollständige Genom der Stämme sequenziert. Hierdurch wurden erstmals Mutationen in verschiedenen Genen mit der Langzeittemperaturtoleranz von Synechocystis in Verbindung gebracht. Bei einigen dieser Gene ist es sehr unwahrscheinlich, dass sie mittels anderer Verfahren hätten identifiziert werden können. N2 - The goal of this work was the increase of the thermal tolerance of the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 via random mutagenesis and adaptive evolution. Even with the renewed interest in cyanobacteria in the recent years, there is relatively limited current research available on the application of these methods on cyanobacteria. To analyse a mixture of various strains typically obtained through random mutagenesis, a method allowing high-throughput miniaturized cultivation and screening is of great advantage. Based on a pipetting robot a novel high-throughput screening system suitable for phototrophic microorganisms was developed and then constantly improved. The cultivation was performed in 2,2 ml deepwell microtiter plates within a cultivation chamber outfitted with programmable shaking conditions, variable illumination, variable temperature, and an adjustable CO2 atmosphere. The platform allows semi-continuous cultivation of hundreds of cultures in parallel. Automated measurements of growth, full absorption spectrum, chlorophyll concentration, MALDI-TOF-MS, as well as a novel vitality measurement protocol, have been established. Prior to the mutagenesis, the lethality and rate of non-lethal point mutations of ultraviolet radiation and methyl-methanesulphonate were characterized for Synechocystis. The thus determined optimal dosages were applied to Synechocystis followed by in vivo selection in four rounds of mutagenesis, thereby raising its temperature tolerance by 3°C. The screening platform was used to identify the most thermotolerant monoclonal strains. After validation, their whole genomes were sequenced. Thus mutations in various genes were identified which promote the strains'' thermal tolerance. For some of the genes it is very unlikely that their link to high thermal tolerance could have been identified by other approaches. KW - liquid handling KW - Cyanobakterien KW - Thermotoleranz KW - Adaptive Evolution Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18307 ER - TY - THES A1 - Lux, Helge T1 - Carbon-based functional Materials for Application in Photonics, Optoelectronics and Sensorics N2 - In this work, two different processes to deposit Graphene-based transparent conductive films on arbitrary insulting substrates have been developed and examined. The first process is a PE-CVD, based on a gas mixture containing hydrocarbons (e.g. methane) inside a vacuum chamber where the insulating substrates are placed on a temperature controlled heating plate. The second process uses a pulsed filtered vacuum arc system (Phi-HCA) to homogeneously deposit a small, well defined amount of carbon on heated substrates. The substrates are tilted with respect to the particle beam and placed on a heating plate. A gas atmosphere consisting of Argon or Argon/Hydrogen decreases the particle energy and influences the morphology of the growing film. For both processes, Scanning Tunneling Microscopy (STM), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Raman spectra have been used for a thorough characterization of the samples in order to optimize the growth parameters. Subsequently, the results (sheet resistance, Hall mobility, transmittance) have been compared with respect to the state of the art, reported in literature. The best carbon layers have a surface resistance of 5E3 Ohm_sqr while the optical transparency of the coatings is 88% with an excellent homogeneity over areas of several cm^2. Both for the PE-CVD and the Phi-HCA, the area of deposition is only limited by the respective area of the heated surface. The obtained results and the fact, that the process can be compatible with most semiconductor fabrication processes, makes them promising for various industrial applications. KW - graphene KW - carbon KW - HCA KW - PECVD KW - Raman Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-13916 ER - TY - THES A1 - Marehn, David Thomas T1 - Reliability of Data Acquisition and Processing Approaches for Chromatography Detection Systems in Pharmacy N2 - Nowadays pharmaceutical analysis and industry could not be imagined without using chromatographic methods like the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Gas Chromatography (GC). Therefore, the field of chromatography is already firmly anchored in the three important, regional pharmacopeias: EP, USP and JP. Deficits of specifications within these pharmacopoeias relating to the detector parameters sampling rate and signal filtration are the major motivation of this thesis. Furthermore investigations on the data acquisition and processing within the detectors and software products dealing with collected data were done. Several concepts like double entry method, smoothing optimization and signal filtration based on persistence have been developed and are used as tools to examine the data integrity of commercial Chromatography Data System (CDS), improve the signal-to-noise ratio of small peaks to lower the LOD and LOQ by efficient denoising, and determine the suitable filter parameters and sampling rates an user can apply on his system to accelerate the method development and validation. All developments have been tested on simulated and real chromatograms and have shown that they are suitable for their specific purposes. In the end optimizations in the concepts still exist but some new aspects in the long-term investigated field of chromatography have been discovered. KW - sampling rate KW - chromatography KW - signal filtration Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-15438 ER - TY - THES A1 - Aymelek (geb. Zinchenko), Tetiana T1 - Reliability Assessment of Vehicle-to-Vehicle Communication N2 - V2V communication enables a plethora of cooperative applications aimed at reducing road hazard situations as well as enhancing traffic efficiency and individual driving comfort, expanding therewith the boundaries of Advanced Driver Assistance Systems (ADAS). These applications will be supported by IEEE 802.11p, a standard operating in the 5.9 GHz frequency band and adapted for the highly dynamic vehicular environment. The focus of this work is V2V safety applications, which have already gained a major attention from the industry, academia, as well as standardization bodies. Being a subject of wireless communication the performance of V2V applications directly depends on the communication link quality and the packet distribution pattern. Therefore, the main purpose of this thesis is to develop an effective communication link reliability assessment method and analyze to what extent V2V communication is feasible to satisfy the reliability requirements of safety applications. Furthermore, we investigate the effectiveness of the proposed assessment method when applied for real-time communication link reliability prediction. In particular, in this work we establish the link between classical network performance metrics and specific application reliability requirements and derive a set of advanced assessment metrics. Afterwards, we investigate through these metrics how different environmental factors affect application reliability based on the measurement data, which was obtained in elaborated real-world measurement campaigns and in different non-line-of-sight scenarios. Using the suggested metrics further in this work we additionally analyze the achievable application reliability of the V2V safety applications in congested network scenarios through the simulation study. Based on these results we also define the most favorable combinations of the network parameters to support reliable operation of these applications. Finally, in this thesis we examine to what extent the suggested metrics are suitable for applications while operating in real time. We develop and implement two frameworks for prediction of the communication link reliability, based on the data that was obtained over the 4.5 months of the simTD project field trials. Furthermore, we apply both frameworks to other measurement data, which was obtained outside the simTD project and assess the effectiveness of both frameworks under independent realistic conditions. Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14716 ER - TY - THES A1 - Radke, Lars T1 - Evaluierung der Potenz von glykosylierten Impfstoffen am Beispiel des RSV-F Proteins N2 - Trotz intensiver Forschung und immensen Bedarfs steht heutzutage kein RSV-Impfstoff zur Verfügung. Moderne Subunit-Vakzine bedürfen einer Adjuvantierung, um eine ausreichend starke Immunantwort zu generieren. Mit der Veränderung von Glykoslierungsmustern des RSV-F Proteins wird eine kovalent gekoppelte Adjuvantierung hergestellt, die über die Aktivierung des angeborenen Immunsystems eine umfassende Immunantwort generiert. In dieser Arbeit wurden rekombinant hergestellte Varianten des RSV-F Proteins mit defukosylierten oder xylosylierten N-Glykanen auf ihr Potential, das Immunsystem zu aktivieren, untersucht. Dazu wurden Zytokine aus Zellkulturüberständen quantifiziert und Methoden zur Genexpressionsanalyse stimulierter Zellen etabliert. In Vorbereitung auf Stimulationsexperimente mit PBMCs wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf Zellen untersucht und die Zytokinexpression auf Gen- und Proteinebene korreliert. Im Rahmen der Stimulationsexperimente mit komplexen Zellgemischen (PBMC und mDC) wurden die stabil exprimierten Referenzgene SDHA, TBP und PPIA für die Etablierung einer validen Genexpressionsanalyse identifiziert. Dabei wurde eine mathematische Konvertierung quantitativer Transkriptzahlen aus dem Sonden-basierten direkten RNA-Nachweis (NanoString®) und der relativen Quantifizierung mittels qPCR entwickelt. Die Zytokinmuster in Zellkulturüberständen aus Langzeitstimulationsexperimenten, welche mit PBMC, mDC und den beiden Impfstoffvarianten in einem komplexen Perfusionsreaktorsystem (HuALN®) durchgeführt worden waren, wurden mittels automatisierter Bead-basierter Multiplexanalytik quantifiziert. Im Zusammenhang mit der Untersuchung umfangreicher Genpanels konnten verstärkte Immunreaktionen durch die glykosidisch veränderten RSV-F Proteine nachgewiesen werden. Die Defukosylierung führt zu einer breiten Aktivierung des zellulären und humoralen adaptiven Immunsystems. Das xylosylierte RSV-F aktiviert zusätzlich Komponenten des angeborenen Immunsystems. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass durch den Grad der Defukosylierung das Verhältnis zwischen Th1 und Th2 basierter Antwort modifiziert werden kann. Mit den verwendeten und etablierten Methoden ist es möglich, die Potenz von Impfstoffkandidaten mit geringen strukturellen Veränderungen zu unterscheiden. Um die komplexen Stimulationsexperimente in einem höheren Durchsatz durchführen zu können, wurde an der Entwicklung eines miniaturisierten Bioreaktors mitgewirkt. Die Untersuchungen der Dichtheit des Reaktors mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Biokompatibilität der einzelnen Komponenten hatten direkten Einfluss auf das Design des Reaktors, dessen Aufbau- und Verbindungstechnik sowie die Wahl der Materialien. Die Funktionalität konnte in verschiedenen 2D und 3D Kultivierungsansätzen über eine langanhaltende Zellviabilität bestätigt werden. Die verstärkte Modulierung der Immunantwort, hervorgerufen durch modifizierte Glykanstrukturen, zeugt von einer aussichtsreichen Methode, die auf andere Pathogene angewandt werden kann. Das höhere Durchsatzpotential des miniaturisierten Perfusionsreaktors (mehr Zeitpunkte, mehr Replikate) kann zukünftig einen präziseren Einblick in die immunologischen Vorgänge gewähren. N2 - Despite intense research and immense demand there is no RSV vaccine available today. Modern subunit vaccines require adjuvants to generate a sufficiently strong immune response. By editing the glycosylation pattern of the RSV-F Protein covalently coupled adjuvants are produced, which generate comprehensive immune responses via the activation of the innate immune system. In this work recombinantly produced variants of the RSV-F protein with defucosylated or xylosylated Nglycans were tested for their potential to activate the immune system. For that, cytokines from cell culture supernatants were quantified and methods for gene expression analysis of stimulated cells were established. In preliminary PBMC stimulation experiments the influence of cryopreservation on cells was examined and the expression of cytokines on gene and protein level was correlated. Within the scope of stimulation experiments with complex cell mixtures (PBMC and DC) the reference genes SDHA, TBP and PPIA were identified as stably expressed in order to establish a valid gene expression analysis. A mathematical conversion of quantitative transcript numbers from a probe-based direct RNA detection assay (NanoString®) and the relative quantification via qPCR was developed. The cytokine pattern in cell culture supernatants from long-term experiments performed with PBMC, mDC and each vaccine candidate in a highly complex perfusion reactor system (HuALN®) were quantified by automated bead-based multiplex analytics. In connection with the analysis of broad gene panels increased immune responses could be detected caused by the glycosidically altered RSV-F proteins. Defucosylation leads to a comprehensive activation of the immune system. Xylosylated RSV-F additionally activates components of the innate immune system. Furthermore, there is evidence that the ratio of the Th1 and Th2 based immune response can be modified by the grade of the defucosylation. The applied and established methods are suited to distinguish the potency of vaccine candidates with minor structural differences. In order to perform stimulation experiments in a higher throughput, this work contributed to the establishment of a miniaturized bioreactor. Leakage testing of the reactor via fluorescence microscopy and the examination of the biocompatibility of all single components directly influenced the reactor design, its assembly and connection techniques as well as the choice of materials. The reactors functionality was confirmed in different 2D and 3D cultivation approaches by means of a long-lasting high cell viability. The stronger modulated immune response evoked by modified glycosidic structures provides a promising method that can be applied to other pathogens, too. By its potential for higher throughput (more time points, more replicas) the miniaturized perfusion reactor could be able to provide a more precise insight into the immunological processes. KW - RSV-F KW - Glycosylation KW - vaccine KW - xylosylation KW - defucosylation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14162 ER - TY - THES A1 - Richter, Michael T1 - Neue Strategien in der Instandhaltung von Fahrzeugen des SPNV N2 - Damit Instandhaltungsarbeiten an Schienenfahrzeugen fachgerecht veranlasst werden können, sind die Eisenbahnverkehrsunternehmen (EVU) auf eigene oder externe Kompetenzen wie die der DB AG angewiesen. Hier setzt die Untersuchung an, den aktuellen Stand der Fahrzeuginstandhaltung im deutschen Schienenpersonennahverkehr zu betrachten. Ausgehend von der Darstellung der Struktur des deutschen SPNV und den sich daraus ergebenden Auswirkungen auf Instandhaltungsdienstleistungen, wird die Rolle und der Einfluss der Akteure Politik/Aufgabenträger, EVU und Fahrzeughersteller bzw. Dienstleister in diesem Feld untersucht. Herausgearbeitet wird, • inwieweit die Fahrzeuginstandhaltung ihren Beitrag zur Steigerung der Effizienz und Effektivität des Gesamtsystems leisten kann, • welche strategischen Trends zu erwarten und damit Herausforderungen voraussichtlich zukünftig zu bewältigen sind sowie • welche Handlungsalternativen dafür am erfolgversprechendsten erscheinen. Dabei basiert die Betrachtung auf empirischen Felduntersuchungen rund um das Thema Instandhaltung, ohne die Instandhaltungskosten selbst zu berücksichtigen, wobei abschließend eine quantitative und qualitative Beurteilung entsteht. Hauptziel ist ein Leitfaden für Entscheidungsträger, um einen lebendigen Wettbewerb verbunden mit einer hohen Qualität bei Bewahrung der Einflussmöglichkeiten sicherzustellen. Bislang veröffentlichte Untersuchungen beziehen sich auf den jeweiligen Akteur Aufgabenträger, Betreiber oder Fahrzeughersteller sowie auf Beziehungen zwischen den Handelnden im System, ohne konkret auf die Instandhaltung der Fahrzeuge einzugehen. Meist wurden die Studien z.B. von diesen selbst oder übergreifend deren Verbänden in Auftrag gegeben. Die hier vorliegende Arbeit hingegen untersucht unabhängig die gemeinsamen Beziehungen zwischen allen drei Akteuren erstmals unter dem Fokus Instandhaltung der Fahrzeuge des SPNV. KW - Fahrzeug KW - Instandhaltung KW - Schienenpersonennahverkehr KW - Zusammenarbeit Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14721 ER - TY - THES A1 - Fischbach, Jens T1 - Isothermale Amplifikationsmethoden für den DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Pathogennachweis N2 - Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich. N2 - Background: Established protein- and nucleic acid-based methods for the specific pathogen detection are usually performed under standardized laboratory conditions by trained staff and are associated with long processing time and high costs. In nucleic acid-based pathogen diagnostics, the isothermal amplification can be used as a rapid and cost-effective alternative to the polymerase chain reaction (PCR). Among all isothermal techniques, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) offers a wide range of applications for the rapid endpoint and real-time detection. A major goal of this work, was to improve the applicability of LAMP and the development of a new method to get a simple, fast and cost-effective diagnostic tool that is based on the detection of DNA and pyrophosphate. For this purpose, direct and indirect detection methods were investigated as well as additional metal ion-dependent fluorescent dyes for the selective detection of pyrophosphate in LAMP or other enzymatic reactions identified. As an alternative to the DNA-based digital LAMP, the previously established dyes were tested for the detection of pyrophosphate in emulsion. Finally, a new reaction mechanism was developed that allows the efficient generation of high molecular weight DNA under isothermal reaction conditions. Results: The detection of RNA- and DNA-based phytopathogens in closed reactions was established successfully with different dyes for real-time and endpoint detection. Berberine as DNA-intercalating fluorescent dye was used in the real-time detection of LAMP with comparable sensitivity to SYBR Green and EvaGreen for the first time. Additionally, the results revealed adequate tolerance of the Bst DNA polymerase to higher concentrations of the dye. Thus, it could be used directly in a closed LAMP reaction without any optimization. Furthermore, the magnesium indicator hydroxynaphthol blue (HNB) was used for fluorometric real-time detection in LAMP for the first time. To extend the number of indirect detection methods for the accumulating pyrophosphate in LAMP and other enzymatic reactions, new metal-ion-dependent dyes were identified. The developed platform could support the iterative process of finding new fluorescent dyes with regard to enzyme compatibility and their spectral properties in the presence or absence of manganese ions. To obtain a selective fluorometric displacement assay, the complex concentration dependence between all components was investigated successfully by the establishment of a combinatorial screening in a microtiter plate. The visualization of the calculated signal-to-noise ratio was then used to identify alizarin red S and tetracycline as promising candidates under simulated reaction conditions. By testing both dyes in the enzymatic assay, alizarin red S was confirmed as low-cost, non-toxic and robust dye for the pyrophosphate dependent increase of the fluorescence intensity. The previously established dyes (HNB, calcein and alizarin red S) were applied successfully for the indirect and fluorometric detection of pyrophosphate in a LAMP-optimized emulsion. The stability and homogeneity of the generated emulsion was increased by adding the surfactant poloxamer 188. The fluorescence microscopic analysis showed a distinct discrimination between positive and negative droplets, in particular by using calcein, HNB and alizarin red S. Additionally, a new amplification reaction that is also based on the Bst DNA polymerase was developed to prevent the complicated primer design and likelihood of unspecific amplification in LAMP. The efficient regeneration of the single stranded priming site was achieved by the integration of a specific linker (abasic site or hexaethylenglycol) between two priming sites to create a bifunctional hinge-primer. After the hybridization on the template sequence, the hinge-primer was used to induce the refolding to a hairpin structure and for blocking the polymerase activity on the reverse strand. Thus, an autocyclic amplification can be achieved at isothermal reaction conditions. Finally, the efficiency of the hinge-initiated primer dependent amplification (HIP) was improved by decreasing the distance between the modified hinge-primer and the corresponding PCR-like primer. Conclusion: Due to its robustness and efficiency, LAMP has been developed to a powerful alternative for the standardized PCR-based diagnostics in molecular biology in the past years. Different detection methods improve the performance of the qualitative and quantitative LAMP in field applications as well as in diagnostics. The new DNA and pyrophosphate based assays can be used in closed reactions and contribute to a simple pathogen detection. Furthermore, the advancements can lead to a considerable reduction of costs and time compared to conventional methods. An attractive achievement is the further optimization of the HIP as sensitive pathogen assay by using LAMP-based detection methods. The use of Bst DNA polymerasedependent reactions will allow a robust integration of the isothermal amplification in microfluidic systems. By combining sample preparation, amplification and detection in one device, powerful applications with short analysis time and low instrumental requirements are a future perspective in pathogen diagnostics. KW - DNA KW - LAMP KW - Pathogen KW - Isothermale Amplifikation KW - Pyrophosphat Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18314 UR - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:kobv:517-opus4-406072 ER -