TY - THES A1 - Fischbach, Jens T1 - Isothermale Amplifikationsmethoden für den DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Pathogennachweis N2 - Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleinsäure-basierte Methoden für den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchführbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleinsäure-basierten Diagnostik kann durch die Einführung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kostengünstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielfältige Detektionsmöglichkeiten, die sowohl für Schnelltest- als auch für Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode für den einfachen, schnellen und günstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abhängiger Detektionsverfahren. Hier wurden zunächst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe für die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden können. Als Alternative für die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe für den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus für die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: Für den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivität zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegenüber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zusätzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen für die Endpunktdetektion verwendet werden. Darüber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das für den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch für die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zusätzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abhängige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP über das Pyrophosphat identifiziert werden. Dafür wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilität und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden können. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabhängigkeit zwischen den einzelnen Komponenten für einen fluorimetrischen Verdrängungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verhältnis’ als Intensitätsmatrix (heatmap) konnten zunächst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als günstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abhängige Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich für die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilität und Homogenität der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tröpfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S möglich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abhängige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gewährleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die Rückfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivität am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur möglich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification“ (HIP) konnte abschließend durch die Verkürzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-ähnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsfähigen Alternative für die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsfähigkeit der qualitativen und quantitativen LAMP für die Feldanwendungen und für die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abhängigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden können und so eine einfache Pathogendiagnostik ermöglichen. Die gezeigten Methoden können darüber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegenüber den herkömmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP für den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei können die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abhängigen Reaktionen ermöglicht darüber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zukünftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik möglich. N2 - Background: Established protein- and nucleic acid-based methods for the specific pathogen detection are usually performed under standardized laboratory conditions by trained staff and are associated with long processing time and high costs. In nucleic acid-based pathogen diagnostics, the isothermal amplification can be used as a rapid and cost-effective alternative to the polymerase chain reaction (PCR). Among all isothermal techniques, the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) offers a wide range of applications for the rapid endpoint and real-time detection. A major goal of this work, was to improve the applicability of LAMP and the development of a new method to get a simple, fast and cost-effective diagnostic tool that is based on the detection of DNA and pyrophosphate. For this purpose, direct and indirect detection methods were investigated as well as additional metal ion-dependent fluorescent dyes for the selective detection of pyrophosphate in LAMP or other enzymatic reactions identified. As an alternative to the DNA-based digital LAMP, the previously established dyes were tested for the detection of pyrophosphate in emulsion. Finally, a new reaction mechanism was developed that allows the efficient generation of high molecular weight DNA under isothermal reaction conditions. Results: The detection of RNA- and DNA-based phytopathogens in closed reactions was established successfully with different dyes for real-time and endpoint detection. Berberine as DNA-intercalating fluorescent dye was used in the real-time detection of LAMP with comparable sensitivity to SYBR Green and EvaGreen for the first time. Additionally, the results revealed adequate tolerance of the Bst DNA polymerase to higher concentrations of the dye. Thus, it could be used directly in a closed LAMP reaction without any optimization. Furthermore, the magnesium indicator hydroxynaphthol blue (HNB) was used for fluorometric real-time detection in LAMP for the first time. To extend the number of indirect detection methods for the accumulating pyrophosphate in LAMP and other enzymatic reactions, new metal-ion-dependent dyes were identified. The developed platform could support the iterative process of finding new fluorescent dyes with regard to enzyme compatibility and their spectral properties in the presence or absence of manganese ions. To obtain a selective fluorometric displacement assay, the complex concentration dependence between all components was investigated successfully by the establishment of a combinatorial screening in a microtiter plate. The visualization of the calculated signal-to-noise ratio was then used to identify alizarin red S and tetracycline as promising candidates under simulated reaction conditions. By testing both dyes in the enzymatic assay, alizarin red S was confirmed as low-cost, non-toxic and robust dye for the pyrophosphate dependent increase of the fluorescence intensity. The previously established dyes (HNB, calcein and alizarin red S) were applied successfully for the indirect and fluorometric detection of pyrophosphate in a LAMP-optimized emulsion. The stability and homogeneity of the generated emulsion was increased by adding the surfactant poloxamer 188. The fluorescence microscopic analysis showed a distinct discrimination between positive and negative droplets, in particular by using calcein, HNB and alizarin red S. Additionally, a new amplification reaction that is also based on the Bst DNA polymerase was developed to prevent the complicated primer design and likelihood of unspecific amplification in LAMP. The efficient regeneration of the single stranded priming site was achieved by the integration of a specific linker (abasic site or hexaethylenglycol) between two priming sites to create a bifunctional hinge-primer. After the hybridization on the template sequence, the hinge-primer was used to induce the refolding to a hairpin structure and for blocking the polymerase activity on the reverse strand. Thus, an autocyclic amplification can be achieved at isothermal reaction conditions. Finally, the efficiency of the hinge-initiated primer dependent amplification (HIP) was improved by decreasing the distance between the modified hinge-primer and the corresponding PCR-like primer. Conclusion: Due to its robustness and efficiency, LAMP has been developed to a powerful alternative for the standardized PCR-based diagnostics in molecular biology in the past years. Different detection methods improve the performance of the qualitative and quantitative LAMP in field applications as well as in diagnostics. The new DNA and pyrophosphate based assays can be used in closed reactions and contribute to a simple pathogen detection. Furthermore, the advancements can lead to a considerable reduction of costs and time compared to conventional methods. An attractive achievement is the further optimization of the HIP as sensitive pathogen assay by using LAMP-based detection methods. The use of Bst DNA polymerasedependent reactions will allow a robust integration of the isothermal amplification in microfluidic systems. By combining sample preparation, amplification and detection in one device, powerful applications with short analysis time and low instrumental requirements are a future perspective in pathogen diagnostics. KW - DNA KW - LAMP KW - Pathogen KW - Isothermale Amplifikation KW - Pyrophosphat Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18314 ER - TY - THES A1 - Grebinyk, Anna T1 - Synergistic Chemo- and Photodynamic Treatment of Cancer Cells with C60 Fullerene Nanocomplexes N2 - Recent progress in nanotechnology has attracted interest to a biomedical application of the carbon nanoparticle C60 fullerene (C60) due to its unique structure and versatile biological activity. In the current study the dual functionality of C60 as a photosensitizer and a drug nanocarrier was exploited to improve the efficiency of chemotherapeutic drugs towards human leukemic cells. Pristine C60 demonstrated time-dependent accumulation with predominant mitochondrial localization in leukemic cells. C60’s effects on leukemic cells irradiated with high power single chip LEDs of different wavelengths were assessed to find out the most effective photoexcitation conditions. A C60-based noncovalent nanosized system as a carrier for an optimized drug delivery to the cells was evaluated in accordance to its physicochemical properties and toxic effects. Finally, nanomolar amounts of C60-drug nanocomplexes in 1:1 and 2:1 molar ratios were explored to improve the efficiency of cell treatment, complementing it with photodynamic approach. A proposed treatment strategy was developed for C60 nanocomplexes with the common chemotherapeutic drug Doxorubicin, whose intracellular accumulation and localization, cytotoxicity and mechanism of action were investigated. The developed strategy was revealed to be transferable to an alternative potent anticancer drug – the herbal alkaloid Berberine. Hereafter, a strong synergy of treatments arising from the combination of C60-mediated drug delivery and C60 photoexcitation was revealed. Presented data indicate that a combination of chemo- and photodynamic treatments with C60-drug nanoformulations could provide a promising synergetic approach for cancer treatment. KW - cancer KW - drug delivery KW - photodynamic therapy KW - fullerene Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14137 ER - TY - THES A1 - Radke, Lars T1 - Evaluierung der Potenz von glykosylierten Impfstoffen am Beispiel des RSV-F Proteins N2 - Trotz intensiver Forschung und immensen Bedarfs steht heutzutage kein RSV-Impfstoff zur Verfügung. Moderne Subunit-Vakzine bedürfen einer Adjuvantierung, um eine ausreichend starke Immunantwort zu generieren. Mit der Veränderung von Glykoslierungsmustern des RSV-F Proteins wird eine kovalent gekoppelte Adjuvantierung hergestellt, die über die Aktivierung des angeborenen Immunsystems eine umfassende Immunantwort generiert. In dieser Arbeit wurden rekombinant hergestellte Varianten des RSV-F Proteins mit defukosylierten oder xylosylierten N-Glykanen auf ihr Potential, das Immunsystem zu aktivieren, untersucht. Dazu wurden Zytokine aus Zellkulturüberständen quantifiziert und Methoden zur Genexpressionsanalyse stimulierter Zellen etabliert. In Vorbereitung auf Stimulationsexperimente mit PBMCs wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf Zellen untersucht und die Zytokinexpression auf Gen- und Proteinebene korreliert. Im Rahmen der Stimulationsexperimente mit komplexen Zellgemischen (PBMC und mDC) wurden die stabil exprimierten Referenzgene SDHA, TBP und PPIA für die Etablierung einer validen Genexpressionsanalyse identifiziert. Dabei wurde eine mathematische Konvertierung quantitativer Transkriptzahlen aus dem Sonden-basierten direkten RNA-Nachweis (NanoString®) und der relativen Quantifizierung mittels qPCR entwickelt. Die Zytokinmuster in Zellkulturüberständen aus Langzeitstimulationsexperimenten, welche mit PBMC, mDC und den beiden Impfstoffvarianten in einem komplexen Perfusionsreaktorsystem (HuALN®) durchgeführt worden waren, wurden mittels automatisierter Bead-basierter Multiplexanalytik quantifiziert. Im Zusammenhang mit der Untersuchung umfangreicher Genpanels konnten verstärkte Immunreaktionen durch die glykosidisch veränderten RSV-F Proteine nachgewiesen werden. Die Defukosylierung führt zu einer breiten Aktivierung des zellulären und humoralen adaptiven Immunsystems. Das xylosylierte RSV-F aktiviert zusätzlich Komponenten des angeborenen Immunsystems. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass durch den Grad der Defukosylierung das Verhältnis zwischen Th1 und Th2 basierter Antwort modifiziert werden kann. Mit den verwendeten und etablierten Methoden ist es möglich, die Potenz von Impfstoffkandidaten mit geringen strukturellen Veränderungen zu unterscheiden. Um die komplexen Stimulationsexperimente in einem höheren Durchsatz durchführen zu können, wurde an der Entwicklung eines miniaturisierten Bioreaktors mitgewirkt. Die Untersuchungen der Dichtheit des Reaktors mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Biokompatibilität der einzelnen Komponenten hatten direkten Einfluss auf das Design des Reaktors, dessen Aufbau- und Verbindungstechnik sowie die Wahl der Materialien. Die Funktionalität konnte in verschiedenen 2D und 3D Kultivierungsansätzen über eine langanhaltende Zellviabilität bestätigt werden. Die verstärkte Modulierung der Immunantwort, hervorgerufen durch modifizierte Glykanstrukturen, zeugt von einer aussichtsreichen Methode, die auf andere Pathogene angewandt werden kann. Das höhere Durchsatzpotential des miniaturisierten Perfusionsreaktors (mehr Zeitpunkte, mehr Replikate) kann zukünftig einen präziseren Einblick in die immunologischen Vorgänge gewähren. N2 - Despite intense research and immense demand there is no RSV vaccine available today. Modern subunit vaccines require adjuvants to generate a sufficiently strong immune response. By editing the glycosylation pattern of the RSV-F Protein covalently coupled adjuvants are produced, which generate comprehensive immune responses via the activation of the innate immune system. In this work recombinantly produced variants of the RSV-F protein with defucosylated or xylosylated Nglycans were tested for their potential to activate the immune system. For that, cytokines from cell culture supernatants were quantified and methods for gene expression analysis of stimulated cells were established. In preliminary PBMC stimulation experiments the influence of cryopreservation on cells was examined and the expression of cytokines on gene and protein level was correlated. Within the scope of stimulation experiments with complex cell mixtures (PBMC and DC) the reference genes SDHA, TBP and PPIA were identified as stably expressed in order to establish a valid gene expression analysis. A mathematical conversion of quantitative transcript numbers from a probe-based direct RNA detection assay (NanoString®) and the relative quantification via qPCR was developed. The cytokine pattern in cell culture supernatants from long-term experiments performed with PBMC, mDC and each vaccine candidate in a highly complex perfusion reactor system (HuALN®) were quantified by automated bead-based multiplex analytics. In connection with the analysis of broad gene panels increased immune responses could be detected caused by the glycosidically altered RSV-F proteins. Defucosylation leads to a comprehensive activation of the immune system. Xylosylated RSV-F additionally activates components of the innate immune system. Furthermore, there is evidence that the ratio of the Th1 and Th2 based immune response can be modified by the grade of the defucosylation. The applied and established methods are suited to distinguish the potency of vaccine candidates with minor structural differences. In order to perform stimulation experiments in a higher throughput, this work contributed to the establishment of a miniaturized bioreactor. Leakage testing of the reactor via fluorescence microscopy and the examination of the biocompatibility of all single components directly influenced the reactor design, its assembly and connection techniques as well as the choice of materials. The reactors functionality was confirmed in different 2D and 3D cultivation approaches by means of a long-lasting high cell viability. The stronger modulated immune response evoked by modified glycosidic structures provides a promising method that can be applied to other pathogens, too. By its potential for higher throughput (more time points, more replicas) the miniaturized perfusion reactor could be able to provide a more precise insight into the immunological processes. KW - RSV-F KW - Glycosylation KW - vaccine KW - xylosylation KW - defucosylation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14162 ER - TY - THES A1 - Tillich, Ulrich M. T1 - Adaptive Evolution und Screening bei Cyanobakterien - Erzeugung und Untersuchung von Thermotoleranz in Synechocystis sp. PCC 6803 N2 - Ziel dieser Arbeit war die Erhöhung der Temperaturtoleranz des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 mittels ungerichteter Mutagenese und adaptiver Evolution. Trotz des erneuten Interesses an Cyanobakterien und Mikroalgen in den letzten Jahren, gibt es nur relativ wenige aktuelle Studien zum Einsatz dieser Methoden an Cyanobakterien. Zur Analyse eines mittels Mutagenese erzeugten Gemischs an Stämmen, ist es von großem Vorteil Hochdurchsatz-Methoden zur Kultivierung und zum Screening einsetzen zu können. Auf Basis eines Pipettierroboters wurde solch eine Plattform für phototrophe Mikroorganismen neu entwickelt und folgend stetig verbessert. Die Kultivierung erfolgt in 2,2ml Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kultivierungskammer. Schüttelbedingungen, Beleuchtung, Temperatur und CO2-Atmosphäre sind hierbei vollständig einstellbar.Die Plattform erlaubt semi-kontinuierliche Kultivierungen mit automatisierten Verdünnungen von hunderten Kulturen gleichzeitig. Automatisierte Messungen des Wachstums, des Absorptionsspektrums, der Chlorophyllkonzentration, MALDI-TOF-MS sowie eines neu entwickelten Vitalitätsassays wurden etabliert. Für die Mutagenese wurden die Letalität- und die nicht-letale Punktmutationsrate von ultravioletter Strahlung und Methylmethansulfonat für Synechocystis charakterisiert. Synechocystis wurde mit den so ermittelten optimalen Dosen mehrfach behandelt und anschließend einer in vivo Selektion unterzogen. Somit wurde dessen Temperaturtoleranz um bis zu 3°C erhöht. Über die Screeningplattform wurden die thermotolerantesten monoklonalen Stämme identifiziert. Nach einer Validierung wurde das vollständige Genom der Stämme sequenziert. Hierdurch wurden erstmals Mutationen in verschiedenen Genen mit der Langzeittemperaturtoleranz von Synechocystis in Verbindung gebracht. Bei einigen dieser Gene ist es sehr unwahrscheinlich, dass sie mittels anderer Verfahren hätten identifiziert werden können. N2 - The goal of this work was the increase of the thermal tolerance of the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 via random mutagenesis and adaptive evolution. Even with the renewed interest in cyanobacteria in the recent years, there is relatively limited current research available on the application of these methods on cyanobacteria. To analyse a mixture of various strains typically obtained through random mutagenesis, a method allowing high-throughput miniaturized cultivation and screening is of great advantage. Based on a pipetting robot a novel high-throughput screening system suitable for phototrophic microorganisms was developed and then constantly improved. The cultivation was performed in 2,2 ml deepwell microtiter plates within a cultivation chamber outfitted with programmable shaking conditions, variable illumination, variable temperature, and an adjustable CO2 atmosphere. The platform allows semi-continuous cultivation of hundreds of cultures in parallel. Automated measurements of growth, full absorption spectrum, chlorophyll concentration, MALDI-TOF-MS, as well as a novel vitality measurement protocol, have been established. Prior to the mutagenesis, the lethality and rate of non-lethal point mutations of ultraviolet radiation and methyl-methanesulphonate were characterized for Synechocystis. The thus determined optimal dosages were applied to Synechocystis followed by in vivo selection in four rounds of mutagenesis, thereby raising its temperature tolerance by 3°C. The screening platform was used to identify the most thermotolerant monoclonal strains. After validation, their whole genomes were sequenced. Thus mutations in various genes were identified which promote the strains'' thermal tolerance. For some of the genes it is very unlikely that their link to high thermal tolerance could have been identified by other approaches. KW - liquid handling KW - Cyanobakterien KW - Thermotoleranz KW - Adaptive Evolution Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18307 ER -