@phdthesis{Fischbach2017, author = {Fischbach, Jens}, title = {Isothermale Amplifikationsmethoden f{\"u}r den DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Pathogennachweis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18314}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {125}, year = {2017}, abstract = {Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleins{\"a}ure-basierte Methoden f{\"u}r den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchf{\"u}hrbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleins{\"a}ure-basierten Diagnostik kann durch die Einf{\"u}hrung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kosteng{\"u}nstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielf{\"a}ltige Detektionsm{\"o}glichkeiten, die sowohl f{\"u}r Schnelltest- als auch f{\"u}r Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode f{\"u}r den einfachen, schnellen und g{\"u}nstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abh{\"a}ngiger Detektionsverfahren. Hier wurden zun{\"a}chst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abh{\"a}ngige Fluoreszenzfarbstoffe f{\"u}r die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden k{\"o}nnen. Als Alternative f{\"u}r die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe f{\"u}r den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus f{\"u}r die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: F{\"u}r den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivit{\"a}t zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegen{\"u}ber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zus{\"a}tzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen f{\"u}r die Endpunktdetektion verwendet werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das f{\"u}r den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch f{\"u}r die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zus{\"a}tzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abh{\"a}ngige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP {\"u}ber das Pyrophosphat identifiziert werden. Daf{\"u}r wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilit{\"a}t und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden k{\"o}nnen. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit zwischen den einzelnen Komponenten f{\"u}r einen fluorimetrischen Verdr{\"a}ngungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verh{\"a}ltnis' als Intensit{\"a}tsmatrix (heatmap) konnten zun{\"a}chst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als g{\"u}nstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abh{\"a}ngige Zunahme der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich f{\"u}r die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilit{\"a}t und Homogenit{\"a}t der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tr{\"o}pfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S m{\"o}glich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gew{\"a}hrleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die R{\"u}ckfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivit{\"a}t am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur m{\"o}glich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification" (HIP) konnte abschließend durch die Verk{\"u}rzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-{\"a}hnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsf{\"a}higen Alternative f{\"u}r die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsf{\"a}higkeit der qualitativen und quantitativen LAMP f{\"u}r die Feldanwendungen und f{\"u}r die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden k{\"o}nnen und so eine einfache Pathogendiagnostik erm{\"o}glichen. Die gezeigten Methoden k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegen{\"u}ber den herk{\"o}mmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP f{\"u}r den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei k{\"o}nnen die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngigen Reaktionen erm{\"o}glicht dar{\"u}ber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zuk{\"u}nftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik m{\"o}glich.}, language = {de} } @article{FischbachFrohmeGloekler2017, author = {Fischbach, Jens and Frohme, Marcus and Gl{\"o}kler, J{\"o}rn}, title = {Hinge-initiated Primer-dependent Amplification of Nucleic Acids (HIP) - A New Versatile Isothermal Amplification Method}, series = {Scientific Reports}, volume = {7}, journal = {Scientific Reports}, issn = {2045-2322}, doi = {10.1038/s41598-017-08067-x}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-9824}, year = {2017}, abstract = {The growing demand for cost-effective nucleic acid detection assays leads to an increasing number of different isothermal amplification reaction methods. However, all of the most efficient methods suffer from highly complex assay conditions due to the use of complicated primer sets and/or auxiliary enzymes. The present study describes the application of a new linker moiety that can be incorporated between a primer and a secondary target binding site which can act both as a block to polymerase extension as well as a hinge for refolding. This novel "hinge-primer" approach results in an efficient regeneration of the primer binding site and thus improves the strand-displacement and amplification process under isothermal conditions. Our investigations revealed that the reaction with forward and reverse hinge-primer including an abasic site is very efficient. The assay complexity can be reduced by combining the hinge-primer with a corresponding linear primer. Furthermore, the reaction speed can be increased by reducing the length of the amplified target sequence. We tested the sensitivity down to 104 copies and found a linear correlation between reaction time and input copy number. Our approach overcomes the usually cumbersome primer-design and extends the range of isothermal amplification methods using a polymerase with strand-displacement activity.}, language = {en} }