@phdthesis{Grebinyk2021, author = {Grebinyk, Anna}, title = {Synergistic Chemo- and Photodynamic Treatment of Cancer Cells with C60 Fullerene Nanocomplexes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14137}, school = {Technische Hochschule Wildau}, year = {2021}, abstract = {Recent progress in nanotechnology has attracted interest to a biomedical application of the carbon nanoparticle C60 fullerene (C60) due to its unique structure and versatile biological activity. In the current study the dual functionality of C60 as a photosensitizer and a drug nanocarrier was exploited to improve the efficiency of chemotherapeutic drugs towards human leukemic cells. Pristine C60 demonstrated time-dependent accumulation with predominant mitochondrial localization in leukemic cells. C60's effects on leukemic cells irradiated with high power single chip LEDs of different wavelengths were assessed to find out the most effective photoexcitation conditions. A C60-based noncovalent nanosized system as a carrier for an optimized drug delivery to the cells was evaluated in accordance to its physicochemical properties and toxic effects. Finally, nanomolar amounts of C60-drug nanocomplexes in 1:1 and 2:1 molar ratios were explored to improve the efficiency of cell treatment, complementing it with photodynamic approach. A proposed treatment strategy was developed for C60 nanocomplexes with the common chemotherapeutic drug Doxorubicin, whose intracellular accumulation and localization, cytotoxicity and mechanism of action were investigated. The developed strategy was revealed to be transferable to an alternative potent anticancer drug - the herbal alkaloid Berberine. Hereafter, a strong synergy of treatments arising from the combination of C60-mediated drug delivery and C60 photoexcitation was revealed. Presented data indicate that a combination of chemo- and photodynamic treatments with C60-drug nanoformulations could provide a promising synergetic approach for cancer treatment.}, subject = {cancer}, language = {en} } @phdthesis{Arndt2010, author = {Arndt, Wulf-Holger}, title = {Optimierungspotenziale im Wirtschaftsverkehr durch bestellerseitige Kooperation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-15497}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {281}, year = {2010}, abstract = {Es wird ein neuer Ansatz zur Verkehrs- und Kostenreduzierung im Wirtschaftsverkehr (genauer Lieferverkehr) untersucht. Die virtuelle Zusammenfassung von Bestellungen z.B. {\"u}ber eine Internet-/Intranetplattform - eine Empf{\"a}nger/Bestellerkooperation kann m{\"o}glicherweise zur B{\"u}ndelung der Lieferverkehre f{\"u}hren. Aufgrund von neuen Produktionsmethoden und Managementstrategien zur St{\"a}rkung der Eigenverantwortlichkeit von Unternehmensbereichen und Abteilungen laufen Bestellprozesse oft separat und unkoordiniert ab. Eine Folge ist die Zersplitterung der Bestellungen und die geringe Auslastung von Lieferverkehren. Neben dieser Dezentralisierung f{\"u}hrt „Outsourcen" dazu, dass Bestellungen immer kleinteiliger und weniger zusammengefasst werden. Um trotzdem Kosten zu sparen versuchen Lieferanten B{\"u}ndelungen durchzuf{\"u}hren. Dies geschieht bei Spedition am ehesten unternehmensintern aber auch in Netzwerken oder bei der City-Logistik auch {\"u}berbetrieblich als Versenderkooperation. Dies ist aber nur die eine Seite des Beschaffungsprozesses. Außerdem ist der Versenderkooperation durch Konkurrenzsituationen Grenzen gesetzt. Auf der anderen Seite ist eine B{\"u}ndelung (der Bestellungen) ebenfalls denkbar, wenn sich daraus Vorteile f{\"u}r die Besteller ergeben, z.B. Preisreduktionen aufgrund gr{\"o}ßerer Bestellmengen. Das w{\"a}re eine Besteller- bzw. Empf{\"a}ngerkooperation. Die Besteller/Empf{\"a}nger schließen sich zusammen und nehmen durch die Bestellungsb{\"u}ndelung den Versendern und Transporteuren quasi die Abstimmungs-Probleme einer Kooperation untereinander teilweise ab. Werden Lieferprozesse mit in die Kooperation integriert, handelt es sich um eine Beschaffungs-kooperation. Fr{\"u}her war eine solche B{\"u}ndelung auf Bestellerseite durch große bestellende Einheiten (Werksgr{\"o}ße, Zentralisierung, hohe Produktionstiefe,...) per se gegeben. Diese Produktions-methoden sind nicht einfach wieder herstellbar. Eine virtuelle B{\"u}ndelung z.B. mittels E Procurement (u.a. Internet-Bestellplattform) w{\"a}re heute zeitgem{\"a}ß. Diese realisiert quasi eine virtuelle Zentralbestellung innerbetrieblich f{\"u}r dezentral organisierte Strukturen oder {\"u}berbetrieblich zwischen unabh{\"a}ngigen Unternehmen. Die haupts{\"a}chlichen Vorteile einer solchen Kooperation sind neben Prozessvereinfachung, Transparenzerh{\"o}hung sowie Verbesserung der Steuerung und Kontrolle bei der Beschaffung, Kosteneinsparung durch Aufwandsminimierung und Nutzung von Preisrabatten durch B{\"u}ndelung der Bestellmengen von mehreren Bestellern. Im Wirtschaftsverkehr sind Effizienzsteigerung und Verkehrsreduzierung durch Kooperationen noch wenig untersucht. Insbesondere Planungsinstrumente zur F{\"o}rderung solcher Kooperationen m{\"u}ssen entwickelt werden. Innerhalb dieser Arbeit fanden umfangreiche Erhebungen statt. In Felduntersuchungen an der Technische Universit{\"a}t Berlin, verschiedenen Gewerbegebieten, Handelseinrichtungen (Shop-in-Shop-Systemen) und B{\"u}roh{\"a}usern wurden Beschaffungsprozesse, Organisationsprobleme und Kooperationsneigungen analysiert. Auf Grundlage der Erkenntnisse aus diesen quantitativen Befragungen und zus{\"a}tzlichen qualitativen Experteninterviews zur Beschaffung sind verschiedene Varianten des Ansatzes entwickelt worden. In einer abschließenden deutschlandweiten Online-Unternehmensbefragung mit 1.700 auswertbaren Antworten, einer Conjoint-Analyse und weiteren Experteninterviews wurden verkehrliche Wirkungen untersucht, Kooperationsans{\"a}tze bewertet und weiter entwickelt.}, language = {de} } @phdthesis{Tanui2020, author = {Tanui, Josephat}, title = {Detailed study of wood combustion in a fixed bed reactor under oxy-fuel condition}, doi = {10.15771/DISS_2020_1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-15320}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {272}, year = {2020}, abstract = {Biomass fuel is the major source of energy for a significant proportion of the world population. Conventionally, biomass is burned in combustors that use air as oxidizer. The need for efficiency and reduced emissions has led to development of clean combustion technologies such as oxy-fuel combustion. In oxy-fuel combustion technique, fuel is burnt in O2/CO2 environment instead of O2/N2 environment. In spite of biomass being used under oxy-fuel conditions using fixed bed furnaces, there is no detailed study of biomass combustion in fixed bed reactors under oxy-fuel condition. The studies only cover combustion under air-fuel condition. There is no report in the literature on important combustion parameters, viz., flame propagation speed, temperature profiles, ignition time, and species evolution in the fixed bed combustion under oxy-fuel conditions; the studies have been only in air. This work extends the research on biomass conversion to combustion under oxy-fuel conditions. To address these knowledge gaps, this PhD thesis focused on establishing and isolating the role of various CO2 effects on biomass combustion properties using a laboratory fixed bed reactor through experiments and numerical modeling. The fixed bed reactor used in this study was operated in counter-current flame propagation mode. Oxidizer was a mixture of pure O2 and N2 or CO2. Measurement were made for air-fuel condition, oxy-fuel condition of different O2/CO2 mixtures and various initial bed porosity. In this work, all numerical simulations were carried out using a commercial CFD software CD-Adapco (STAR CCM+ version 11.04). Euler-Lagrange (CFD-DEM) approach was used to model biomass conversion in a packed bed. Solid particles and their conversion were modeled using DEM while fluid phase was modeled as a continuous phase using CFD. Biomass conversion was modeled by four sub-models, namely, drying, pyrolysis, gas-phase reactions and char oxidation models. These models were adopted and improved from previous research on wood combustion. To account for oxy-fuel combustion environment, reaction involving CO2 which has been identified as the dominant reaction pathway as well as its associated chain-branching reactions were incorporated in homogeneous reaction sub-model. In order to separate effects of CO2 on wood combustion, four different mixtures of O2 and Ar/CO2/N2 were designed and simulated. Temperature in O2/CO2 combustion environment was adjusted to be equal to that of O2/N2 environment by adding an appropriate amount of Ar while O2 amount remained the same. The results showed that flame front propagation speed in oxy-fuel atmosphere reduced to 78\% of that of the air-fuel condition with similar O2 concentration. The CFD-DEM model agreed very well with experimental values for mass loss, propagation speed and flame front positions. However, peak temperatures were poorly predicted at lower oxygen concentrations. The accuracy of temperature prediction improved at higher oxygen concentrations. It was noted that oxy-fuel peak temperature is lower than air-fuel temperature by about 200 K. For oxy-fuel combustion, peak temperature value and propagation speed increases as O2 concentration is increased. The results showed that at any given oxygen concentration, ignition time in oxy-fuel environment is almost twice that of corresponding air-fuel condition. It was established that the packing density affects combustion process by changing the burning conditions and limits. Furthermore, the study revealed that there is an optimum packing density, χ = 0.71, beyond which the efficiency falls due to the onset of quenching in the spaces. It was concluded that dilution effect is the most influential parameter on the burning rate of wood combustion in an oxy-fuel system. In a future study, the model prediction could be improved by including ash inhibition sub-model and using a full chemical kinetic mechanism for hydro-carbon combustion. It was also recommended that a detail analysis of heat transfer in the bed could be investigated in a future study. The findings from this work are important and may be useful when designing burners which operate under oxy-fuel combustion conditions.}, language = {en} } @phdthesis{Tillich2015, author = {Tillich, Ulrich M.}, title = {Adaptive Evolution und Screening bei Cyanobakterien - Erzeugung und Untersuchung von Thermotoleranz in Synechocystis sp. PCC 6803}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18307}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {135}, year = {2015}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war die Erh{\"o}hung der Temperaturtoleranz des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 mittels ungerichteter Mutagenese und adaptiver Evolution. Trotz des erneuten Interesses an Cyanobakterien und Mikroalgen in den letzten Jahren, gibt es nur relativ wenige aktuelle Studien zum Einsatz dieser Methoden an Cyanobakterien. Zur Analyse eines mittels Mutagenese erzeugten Gemischs an St{\"a}mmen, ist es von großem Vorteil Hochdurchsatz-Methoden zur Kultivierung und zum Screening einsetzen zu k{\"o}nnen. Auf Basis eines Pipettierroboters wurde solch eine Plattform f{\"u}r phototrophe Mikroorganismen neu entwickelt und folgend stetig verbessert. Die Kultivierung erfolgt in 2,2ml Deepwell-Mikrotiterplatten innerhalb einer speziell angefertigten Kultivierungskammer. Sch{\"u}ttelbedingungen, Beleuchtung, Temperatur und CO2-Atmosph{\"a}re sind hierbei vollst{\"a}ndig einstellbar.Die Plattform erlaubt semi-kontinuierliche Kultivierungen mit automatisierten Verd{\"u}nnungen von hunderten Kulturen gleichzeitig. Automatisierte Messungen des Wachstums, des Absorptionsspektrums, der Chlorophyllkonzentration, MALDI-TOF-MS sowie eines neu entwickelten Vitalit{\"a}tsassays wurden etabliert. F{\"u}r die Mutagenese wurden die Letalit{\"a}t- und die nicht-letale Punktmutationsrate von ultravioletter Strahlung und Methylmethansulfonat f{\"u}r Synechocystis charakterisiert. Synechocystis wurde mit den so ermittelten optimalen Dosen mehrfach behandelt und anschließend einer in vivo Selektion unterzogen. Somit wurde dessen Temperaturtoleranz um bis zu 3°C erh{\"o}ht. {\"U}ber die Screeningplattform wurden die thermotolerantesten monoklonalen St{\"a}mme identifiziert. Nach einer Validierung wurde das vollst{\"a}ndige Genom der St{\"a}mme sequenziert. Hierdurch wurden erstmals Mutationen in verschiedenen Genen mit der Langzeittemperaturtoleranz von Synechocystis in Verbindung gebracht. Bei einigen dieser Gene ist es sehr unwahrscheinlich, dass sie mittels anderer Verfahren h{\"a}tten identifiziert werden k{\"o}nnen.}, language = {de} } @phdthesis{Lux2015, author = {Lux, Helge}, title = {Carbon-based functional Materials for Application in Photonics, Optoelectronics and Sensorics}, doi = {10.15771/DISS_2015_1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-13916}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {105}, year = {2015}, abstract = {In this work, two different processes to deposit Graphene-based transparent conductive films on arbitrary insulting substrates have been developed and examined. The first process is a PE-CVD, based on a gas mixture containing hydrocarbons (e.g. methane) inside a vacuum chamber where the insulating substrates are placed on a temperature controlled heating plate. The second process uses a pulsed filtered vacuum arc system (Phi-HCA) to homogeneously deposit a small, well defined amount of carbon on heated substrates. The substrates are tilted with respect to the particle beam and placed on a heating plate. A gas atmosphere consisting of Argon or Argon/Hydrogen decreases the particle energy and influences the morphology of the growing film. For both processes, Scanning Tunneling Microscopy (STM), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Raman spectra have been used for a thorough characterization of the samples in order to optimize the growth parameters. Subsequently, the results (sheet resistance, Hall mobility, transmittance) have been compared with respect to the state of the art, reported in literature. The best carbon layers have a surface resistance of 5E3 Ohm_sqr while the optical transparency of the coatings is 88\% with an excellent homogeneity over areas of several cm^2. Both for the PE-CVD and the Phi-HCA, the area of deposition is only limited by the respective area of the heated surface. The obtained results and the fact, that the process can be compatible with most semiconductor fabrication processes, makes them promising for various industrial applications.}, language = {en} } @phdthesis{Marehn2020, author = {Marehn, David Thomas}, title = {Reliability of Data Acquisition and Processing Approaches for Chromatography Detection Systems in Pharmacy}, doi = {10.15771/DISS_2020_2}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-15438}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {93}, year = {2020}, abstract = {Nowadays pharmaceutical analysis and industry could not be imagined without using chromatographic methods like the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Gas Chromatography (GC). Therefore, the field of chromatography is already firmly anchored in the three important, regional pharmacopeias: EP, USP and JP. Deficits of specifications within these pharmacopoeias relating to the detector parameters sampling rate and signal filtration are the major motivation of this thesis. Furthermore investigations on the data acquisition and processing within the detectors and software products dealing with collected data were done. Several concepts like double entry method, smoothing optimization and signal filtration based on persistence have been developed and are used as tools to examine the data integrity of commercial Chromatography Data System (CDS), improve the signal-to-noise ratio of small peaks to lower the LOD and LOQ by efficient denoising, and determine the suitable filter parameters and sampling rates an user can apply on his system to accelerate the method development and validation. All developments have been tested on simulated and real chromatograms and have shown that they are suitable for their specific purposes. In the end optimizations in the concepts still exist but some new aspects in the long-term investigated field of chromatography have been discovered.}, language = {en} } @phdthesis{AymelekgebZinchenko2014, author = {Aymelek (geb. Zinchenko), Tetiana}, title = {Reliability Assessment of Vehicle-to-Vehicle Communication}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14716}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {173}, year = {2014}, abstract = {V2V communication enables a plethora of cooperative applications aimed at reducing road hazard situations as well as enhancing traffic efficiency and individual driving comfort, expanding therewith the boundaries of Advanced Driver Assistance Systems (ADAS). These applications will be supported by IEEE 802.11p, a standard operating in the 5.9 GHz frequency band and adapted for the highly dynamic vehicular environment. The focus of this work is V2V safety applications, which have already gained a major attention from the industry, academia, as well as standardization bodies. Being a subject of wireless communication the performance of V2V applications directly depends on the communication link quality and the packet distribution pattern. Therefore, the main purpose of this thesis is to develop an effective communication link reliability assessment method and analyze to what extent V2V communication is feasible to satisfy the reliability requirements of safety applications. Furthermore, we investigate the effectiveness of the proposed assessment method when applied for real-time communication link reliability prediction. In particular, in this work we establish the link between classical network performance metrics and specific application reliability requirements and derive a set of advanced assessment metrics. Afterwards, we investigate through these metrics how different environmental factors affect application reliability based on the measurement data, which was obtained in elaborated real-world measurement campaigns and in different non-line-of-sight scenarios. Using the suggested metrics further in this work we additionally analyze the achievable application reliability of the V2V safety applications in congested network scenarios through the simulation study. Based on these results we also define the most favorable combinations of the network parameters to support reliable operation of these applications. Finally, in this thesis we examine to what extent the suggested metrics are suitable for applications while operating in real time. We develop and implement two frameworks for prediction of the communication link reliability, based on the data that was obtained over the 4.5 months of the simTD project field trials. Furthermore, we apply both frameworks to other measurement data, which was obtained outside the simTD project and assess the effectiveness of both frameworks under independent realistic conditions.}, language = {en} } @phdthesis{Radke2019, author = {Radke, Lars}, title = {Evaluierung der Potenz von glykosylierten Impfstoffen am Beispiel des RSV-F Proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14162}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {86}, year = {2019}, abstract = {Trotz intensiver Forschung und immensen Bedarfs steht heutzutage kein RSV-Impfstoff zur Verf{\"u}gung. Moderne Subunit-Vakzine bed{\"u}rfen einer Adjuvantierung, um eine ausreichend starke Immunantwort zu generieren. Mit der Ver{\"a}nderung von Glykoslierungsmustern des RSV-F Proteins wird eine kovalent gekoppelte Adjuvantierung hergestellt, die {\"u}ber die Aktivierung des angeborenen Immunsystems eine umfassende Immunantwort generiert. In dieser Arbeit wurden rekombinant hergestellte Varianten des RSV-F Proteins mit defukosylierten oder xylosylierten N-Glykanen auf ihr Potential, das Immunsystem zu aktivieren, untersucht. Dazu wurden Zytokine aus Zellkultur{\"u}berst{\"a}nden quantifiziert und Methoden zur Genexpressionsanalyse stimulierter Zellen etabliert. In Vorbereitung auf Stimulationsexperimente mit PBMCs wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf Zellen untersucht und die Zytokinexpression auf Gen- und Proteinebene korreliert. Im Rahmen der Stimulationsexperimente mit komplexen Zellgemischen (PBMC und mDC) wurden die stabil exprimierten Referenzgene SDHA, TBP und PPIA f{\"u}r die Etablierung einer validen Genexpressionsanalyse identifiziert. Dabei wurde eine mathematische Konvertierung quantitativer Transkriptzahlen aus dem Sonden-basierten direkten RNA-Nachweis (NanoString®) und der relativen Quantifizierung mittels qPCR entwickelt. Die Zytokinmuster in Zellkultur{\"u}berst{\"a}nden aus Langzeitstimulationsexperimenten, welche mit PBMC, mDC und den beiden Impfstoffvarianten in einem komplexen Perfusionsreaktorsystem (HuALN®) durchgef{\"u}hrt worden waren, wurden mittels automatisierter Bead-basierter Multiplexanalytik quantifiziert. Im Zusammenhang mit der Untersuchung umfangreicher Genpanels konnten verst{\"a}rkte Immunreaktionen durch die glykosidisch ver{\"a}nderten RSV-F Proteine nachgewiesen werden. Die Defukosylierung f{\"u}hrt zu einer breiten Aktivierung des zellul{\"a}ren und humoralen adaptiven Immunsystems. Das xylosylierte RSV-F aktiviert zus{\"a}tzlich Komponenten des angeborenen Immunsystems. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass durch den Grad der Defukosylierung das Verh{\"a}ltnis zwischen Th1 und Th2 basierter Antwort modifiziert werden kann. Mit den verwendeten und etablierten Methoden ist es m{\"o}glich, die Potenz von Impfstoffkandidaten mit geringen strukturellen Ver{\"a}nderungen zu unterscheiden. Um die komplexen Stimulationsexperimente in einem h{\"o}heren Durchsatz durchf{\"u}hren zu k{\"o}nnen, wurde an der Entwicklung eines miniaturisierten Bioreaktors mitgewirkt. Die Untersuchungen der Dichtheit des Reaktors mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Biokompatibilit{\"a}t der einzelnen Komponenten hatten direkten Einfluss auf das Design des Reaktors, dessen Aufbau- und Verbindungstechnik sowie die Wahl der Materialien. Die Funktionalit{\"a}t konnte in verschiedenen 2D und 3D Kultivierungsans{\"a}tzen {\"u}ber eine langanhaltende Zellviabilit{\"a}t best{\"a}tigt werden. Die verst{\"a}rkte Modulierung der Immunantwort, hervorgerufen durch modifizierte Glykanstrukturen, zeugt von einer aussichtsreichen Methode, die auf andere Pathogene angewandt werden kann. Das h{\"o}here Durchsatzpotential des miniaturisierten Perfusionsreaktors (mehr Zeitpunkte, mehr Replikate) kann zuk{\"u}nftig einen pr{\"a}ziseren Einblick in die immunologischen Vorg{\"a}nge gew{\"a}hren.}, language = {de} } @phdthesis{Richter2015, author = {Richter, Michael}, title = {Neue Strategien in der Instandhaltung von Fahrzeugen des SPNV}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14721}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {299}, year = {2015}, abstract = {Damit Instandhaltungsarbeiten an Schienenfahrzeugen fachgerecht veranlasst werden k{\"o}nnen, sind die Eisenbahnverkehrsunternehmen (EVU) auf eigene oder externe Kompetenzen wie die der DB AG angewiesen. Hier setzt die Untersuchung an, den aktuellen Stand der Fahrzeuginstandhaltung im deutschen Schienenpersonennahverkehr zu betrachten. Ausgehend von der Darstellung der Struktur des deutschen SPNV und den sich daraus ergebenden Auswirkungen auf Instandhaltungsdienstleistungen, wird die Rolle und der Einfluss der Akteure Politik/Aufgabentr{\"a}ger, EVU und Fahrzeughersteller bzw. Dienstleister in diesem Feld untersucht. Herausgearbeitet wird, • inwieweit die Fahrzeuginstandhaltung ihren Beitrag zur Steigerung der Effizienz und Effektivit{\"a}t des Gesamtsystems leisten kann, • welche strategischen Trends zu erwarten und damit Herausforderungen voraussichtlich zuk{\"u}nftig zu bew{\"a}ltigen sind sowie • welche Handlungsalternativen daf{\"u}r am erfolgversprechendsten erscheinen. Dabei basiert die Betrachtung auf empirischen Felduntersuchungen rund um das Thema Instandhaltung, ohne die Instandhaltungskosten selbst zu ber{\"u}cksichtigen, wobei abschließend eine quantitative und qualitative Beurteilung entsteht. Hauptziel ist ein Leitfaden f{\"u}r Entscheidungstr{\"a}ger, um einen lebendigen Wettbewerb verbunden mit einer hohen Qualit{\"a}t bei Bewahrung der Einflussm{\"o}glichkeiten sicherzustellen. Bislang ver{\"o}ffentlichte Untersuchungen beziehen sich auf den jeweiligen Akteur Aufgabentr{\"a}ger, Betreiber oder Fahrzeughersteller sowie auf Beziehungen zwischen den Handelnden im System, ohne konkret auf die Instandhaltung der Fahrzeuge einzugehen. Meist wurden die Studien z.B. von diesen selbst oder {\"u}bergreifend deren Verb{\"a}nden in Auftrag gegeben. Die hier vorliegende Arbeit hingegen untersucht unabh{\"a}ngig die gemeinsamen Beziehungen zwischen allen drei Akteuren erstmals unter dem Fokus Instandhaltung der Fahrzeuge des SPNV.}, language = {de} } @phdthesis{Fischbach2017, author = {Fischbach, Jens}, title = {Isothermale Amplifikationsmethoden f{\"u}r den DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Pathogennachweis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-18314}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {125}, year = {2017}, abstract = {Hintergrund: Etablierte Protein- und Nukleins{\"a}ure-basierte Methoden f{\"u}r den spezifischen Pathogennachweis sind nur unter standardisierten Laborbedingungen von geschultem Personal durchf{\"u}hrbar und daher mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden. In der Nukleins{\"a}ure-basierten Diagnostik kann durch die Einf{\"u}hrung der isothermalen Amplifikation eine schnelle und kosteng{\"u}nstige Alternative zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet werden. Die Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) bietet aufgrund der hohen Amplifikationseffizienz vielf{\"a}ltige Detektionsm{\"o}glichkeiten, die sowohl f{\"u}r Schnelltest- als auch f{\"u}r Monitoring-Anwendungen geeignet sind. Ein wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung der Anwendbarkeit der LAMP und die Entwicklung einer neuen Methode f{\"u}r den einfachen, schnellen und g{\"u}nstigen Nachweis von Pathogenen mittels alternativer DNA- oder Pyrophosphat-abh{\"a}ngiger Detektionsverfahren. Hier wurden zun{\"a}chst direkte und indirekte Detektionsmethoden untersucht und darauf aufbauend ein Verfahren entwickelt, mit dem neue Metallionen-abh{\"a}ngige Fluoreszenzfarbstoffe f{\"u}r die selektive Detektion von Pyrophosphat in der LAMP und anderen enzymatischen Reaktionen identifiziert werden k{\"o}nnen. Als Alternative f{\"u}r die DNA-basierte Detektion in der digitalen LAMP sollten die zuvor etablierten Farbstoffe f{\"u}r den Pyrophosphatnachweis in einer Emulsion getestet werden. Abschließend wurde ein neuer Reaktionsmechanismus f{\"u}r die effiziente Generierung hochmolekularer DNA unter isothermalen Bedingungen als Alternative zur LAMP entwickelt. Ergebnisse: F{\"u}r den Nachweis RNA- und DNA-basierter Phythopathogene konnte die Echtzeit- und Endpunktdetektion mit verschiedenen Farbstoffen in einem geschlossenen System etabliert werden. Hier wurde Berberin als DNA-interkalierender Fluoreszenzfarbstoff mit vergleichbarer Sensitivit{\"a}t zu SYBR Green und EvaGreen erfolgreich in der LAMP mit Echtzeitdetektion eingesetzt. Ein Vorteil von Berberin gegen{\"u}ber den anderen Farbstoffen ist die Toleranz der DNA-Polymerase auch bei hohen Farbstoffkonzentrationen. Berberin kann daher auch in der geschlossenen LAMP-Reaktion ohne zus{\"a}tzliche Anpassung der Reaktionsbedingungen f{\"u}r die Endpunktdetektion verwendet werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte Hydroxynaphtholblau (HNB), das f{\"u}r den kolorimetrischen Endpunktnachweis bekannt ist, erstmals auch f{\"u}r die fluorimetrische Detektion der LAMP in Echtzeit eingesetzt werden. Zus{\"a}tzlich konnten in der Arbeit weitere Metallionen-abh{\"a}ngige Farbstoffe zur indirekten Detektion der LAMP {\"u}ber das Pyrophosphat identifiziert werden. Daf{\"u}r wurde eine iterative Methode entwickelt, mit der potenzielle Farbstoffe hinsichtlich ihrer Enzymkompatibilit{\"a}t und ihrer spektralen Eigenschaften bei An- oder Abwesenheit von Manganionen selektiert werden k{\"o}nnen. Mithilfe eines kombinatorischen Screenings im Mikrotiterplattenformat konnte die komplexe Konzentrationsabh{\"a}ngigkeit zwischen den einzelnen Komponenten f{\"u}r einen fluorimetrischen Verdr{\"a}ngungsnachweis untersucht werden. Durch die Visualisierung des Signal-Rausch-Verh{\"a}ltnis' als Intensit{\"a}tsmatrix (heatmap) konnten zun{\"a}chst Alizarinrot S und Tetrazyklin unter simulierten Reaktionsbedingungen selektiert werden. In der anschließenden enzymatischen LAMP-Reaktion konnte insbesondere Alizarinrot S als g{\"u}nstiger, nicht-toxischer und robuster Fluoreszenzfarbstoff identifiziert werden und zeigte eine Pyrophosphat-abh{\"a}ngige Zunahme der Fluoreszenzintensit{\"a}t. Die zuvor etablierten Farbstoffe (HNB, Calcein und Alizarinrot S) konnten anschließend erfolgreich f{\"u}r die indirekte, fluorimetrische Detektion von Pyrophosphat in einer LAMP-optimierten Emulsion eingesetzt werden. Die Stabilit{\"a}t und Homogenit{\"a}t der generierten Emulsion wurde durch den Zusatz des Emulgators Poloxamer 188 verbessert. Durch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Emulsion war eine eindeutige Diskriminierung der positiven und negativen Tr{\"o}pfchen vor allem bei Einsatz von Calcein und Alizarinrot S m{\"o}glich. Aufgrund des komplexen Primer-Designs und der hohen Wahrscheinlichkeit unspezifischer Amplifikation in der LAMP wurde eine neue Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngige isothermale Amplifikationsreaktion entwickelt. Durch die Integration einer spezifischen Linkerstruktur (abasische Stelle oder Hexaethylenglykol) zwischen zwei Primersequenzen konnte ein bifunktioneller Primer die effiziente Regenerierung der Primerbindungsstellen gew{\"a}hrleisten. Der neue Primer induziert nach der spezifischen Hybridisierung auf dem Templat die R{\"u}ckfaltung zu einer Haarnadelstruktur und blockiert gleichzeitig die Polymeraseaktivit{\"a}t am Gegenstrang, wodurch eine autozyklische Amplifikation trotz konstanter Reaktionstemperatur m{\"o}glich ist. Die Effizienz der „Hinge-initiated Primer dependent Amplification" (HIP) konnte abschließend durch die Verk{\"u}rzung der Distanz zwischen einem modifizierten Hinge-Primer und einem PCR-{\"a}hnlichen Primer verbessert werden. Schlussfolgerung: Die LAMP hat sich aufgrund der hohen Robustheit und Effizienz zu einer leistungsf{\"a}higen Alternative f{\"u}r die klassische PCR in der molekularbiologischen Diagnostik entwickelt. Unterschiedliche Detektionsverfahren verbessern die Leistungsf{\"a}higkeit der qualitativen und quantitativen LAMP f{\"u}r die Feldanwendungen und f{\"u}r die Diagnostik, da die neuen DNA- und Pyrophosphat-abh{\"a}ngigen Nachweismethoden in einer geschlossenen Reaktion eingesetzt werden k{\"o}nnen und so eine einfache Pathogendiagnostik erm{\"o}glichen. Die gezeigten Methoden k{\"o}nnen dar{\"u}ber hinaus zu einer Kostensenkung und Zeitersparnis gegen{\"u}ber den herk{\"o}mmlichen Methoden beitragen. Ein attraktives Ziel stellt die Weiterentwicklung der HIP f{\"u}r den Pathogennachweis als Alternative zur LAMP dar. Hierbei k{\"o}nnen die neuen LAMP-Detektionsverfahren ebenfalls Anwendung finden. Die Verwendung von Bst DNA-Polymerase-abh{\"a}ngigen Reaktionen erm{\"o}glicht dar{\"u}ber hinaus die Integration einer robusten isothermalen Amplifikation in mikrofluidische Systeme. Durch die Kombination der Probenvorbereitung, Amplifikation und Detektion sind zuk{\"u}nftige Anwendungen mit kurzer Analysezeit und geringem apparativen Aufwand insbesondere in der Pathogendiagnostik m{\"o}glich.}, language = {de} }