@phdthesis{Radke2019, author = {Radke, Lars}, title = {Evaluierung der Potenz von glykosylierten Impfstoffen am Beispiel des RSV-F Proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:526-opus4-14162}, school = {Technische Hochschule Wildau}, pages = {86}, year = {2019}, abstract = {Trotz intensiver Forschung und immensen Bedarfs steht heutzutage kein RSV-Impfstoff zur Verf{\"u}gung. Moderne Subunit-Vakzine bed{\"u}rfen einer Adjuvantierung, um eine ausreichend starke Immunantwort zu generieren. Mit der Ver{\"a}nderung von Glykoslierungsmustern des RSV-F Proteins wird eine kovalent gekoppelte Adjuvantierung hergestellt, die {\"u}ber die Aktivierung des angeborenen Immunsystems eine umfassende Immunantwort generiert. In dieser Arbeit wurden rekombinant hergestellte Varianten des RSV-F Proteins mit defukosylierten oder xylosylierten N-Glykanen auf ihr Potential, das Immunsystem zu aktivieren, untersucht. Dazu wurden Zytokine aus Zellkultur{\"u}berst{\"a}nden quantifiziert und Methoden zur Genexpressionsanalyse stimulierter Zellen etabliert. In Vorbereitung auf Stimulationsexperimente mit PBMCs wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf Zellen untersucht und die Zytokinexpression auf Gen- und Proteinebene korreliert. Im Rahmen der Stimulationsexperimente mit komplexen Zellgemischen (PBMC und mDC) wurden die stabil exprimierten Referenzgene SDHA, TBP und PPIA f{\"u}r die Etablierung einer validen Genexpressionsanalyse identifiziert. Dabei wurde eine mathematische Konvertierung quantitativer Transkriptzahlen aus dem Sonden-basierten direkten RNA-Nachweis (NanoString®) und der relativen Quantifizierung mittels qPCR entwickelt. Die Zytokinmuster in Zellkultur{\"u}berst{\"a}nden aus Langzeitstimulationsexperimenten, welche mit PBMC, mDC und den beiden Impfstoffvarianten in einem komplexen Perfusionsreaktorsystem (HuALN®) durchgef{\"u}hrt worden waren, wurden mittels automatisierter Bead-basierter Multiplexanalytik quantifiziert. Im Zusammenhang mit der Untersuchung umfangreicher Genpanels konnten verst{\"a}rkte Immunreaktionen durch die glykosidisch ver{\"a}nderten RSV-F Proteine nachgewiesen werden. Die Defukosylierung f{\"u}hrt zu einer breiten Aktivierung des zellul{\"a}ren und humoralen adaptiven Immunsystems. Das xylosylierte RSV-F aktiviert zus{\"a}tzlich Komponenten des angeborenen Immunsystems. Zudem gibt es Hinweise darauf, dass durch den Grad der Defukosylierung das Verh{\"a}ltnis zwischen Th1 und Th2 basierter Antwort modifiziert werden kann. Mit den verwendeten und etablierten Methoden ist es m{\"o}glich, die Potenz von Impfstoffkandidaten mit geringen strukturellen Ver{\"a}nderungen zu unterscheiden. Um die komplexen Stimulationsexperimente in einem h{\"o}heren Durchsatz durchf{\"u}hren zu k{\"o}nnen, wurde an der Entwicklung eines miniaturisierten Bioreaktors mitgewirkt. Die Untersuchungen der Dichtheit des Reaktors mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Biokompatibilit{\"a}t der einzelnen Komponenten hatten direkten Einfluss auf das Design des Reaktors, dessen Aufbau- und Verbindungstechnik sowie die Wahl der Materialien. Die Funktionalit{\"a}t konnte in verschiedenen 2D und 3D Kultivierungsans{\"a}tzen {\"u}ber eine langanhaltende Zellviabilit{\"a}t best{\"a}tigt werden. Die verst{\"a}rkte Modulierung der Immunantwort, hervorgerufen durch modifizierte Glykanstrukturen, zeugt von einer aussichtsreichen Methode, die auf andere Pathogene angewandt werden kann. Das h{\"o}here Durchsatzpotential des miniaturisierten Perfusionsreaktors (mehr Zeitpunkte, mehr Replikate) kann zuk{\"u}nftig einen pr{\"a}ziseren Einblick in die immunologischen Vorg{\"a}nge gew{\"a}hren.}, language = {de} }