TY - THES A1 - Bernardi, Beatrice T1 - Characterization of hybrid genes and copy number variations in lager yeast strains N2 - ZUSAMMENFASSUNG Lagerhefen sind hybride Organismen, welche aus einer Zellfusion zweier Spezies der Gattung Saccharomyces, S. cerevisiae und S. eubayanus, entstanden sind. Vorgänge, welche nach der Hybridisierung stattfinden, wie zum Beispiel die Veränderung der Kopienzahl (CNV), der Chromosomenverlust, wechselseitige Translokationen oder interchromosomale Neuordnungen können die Genomgröße, die Ploidie oder die Sporulationseffizienz beeinflussen. Bei polyploiden Hybriden erschwert das Vorhandensein mehrerer Allele eines Gens funktionelle Studien, die auf einer Gen-Manipulation beruhen, z. B. Gen- Deletionen. Die meisten an Hefen angewendeten gentechnischen Methoden basieren auf die homologe Rekombinationsmaschinerie (HR) der Hefe, die bei S. cerevisiae hervorragend funktioniert, bei Lagerhefen jedoch eine geringe Effizienz aufweist. In dieser Arbeit entwickelte ich eine Strategie zur Verbesserung der HR-Effizienz von Lagerhefe, die ein kurzflankiges (sf) PCR-basiertes Gen-Targeting ermöglicht. Die HR-Effizienz wurde erfolgreich durch eine Überexpression von RAD51 verbessert, das einen Schlüsselregulator des HR-Signalwegs codiert, der die Suche nach komplementären DNA-Strängen während der Rekombination übernimmt. Die erfolgreiche Verbesserung des sf-PCR-basierten Gen-Targetings in Lagerhefe wurde durch Targeting der von S. cerevisiae abgeleiteten Loci von ADE2 und HSP104 in der allotetraploiden Lagerhefe Weihenstephan 34/70 gezeigt. Diese Technik kann nun zur Vereinfachung der Gentechnik in Lagerhefe verwendet werden, z. B. durch Veränderung der Expression spezifischer Gene, die an der Würzefermentation und der Geschmacksbildung beteiligt sind. Andere Mechanismen der Genomentwicklung sind die Aufnahme von DNA durch horizontalen Gentransfer oder Introgression. Diese wurden in einem Apfelwein-Hefestamm genauer untersucht. Die Genomsequenzierung zeigte, dass es sich um ein bestimmtes Saccharomyces uvarum Isolat handelt. Interessanterweise haben wir bei diesem Stamm die Übernahme von ~100 kb der DNA von S. eubayanus identifiziert, die 54 Gen-ORFs auf Chromosom XIV enthält. Eine auf DNA-Polymorphismus basierende Analyse legt nahe, dass einLagerhefestamm wahrscheinlich eher der elterliche Spender dieser DNA ist als ein S. eubayanus-Stamm. Eine zusätzliche DNA-Insertion mit starker Ähnlichkeit zu Torulaspora microellipsoides wurde auf Chromosom XII gefunden. Die Introgression dieser speziellen DNA-Region wurde zuvor bei mehreren Weinhefestämmen beobachtet. Diese enthält 19 weineigene Gene wie FOT1/FOT2, die für den Pilz-Oligopeptid-Transporter Fot kodieren, der Vorteile bei der Stickstoffverwertung bietet. Auffallend ist, dass das S. uvarum- Apfelweinisolat die S. cerevisiae EC1118, welche als Zugpferd der Weinindustrie in Standard- und Kaltgärungen gilt, übertrifft und verdrängen könnte. Bier- und Weinhefen zeichnen sich durch ihre Flokkulations-Eigenschaften am Ende der Fermentation aus. Die Flokkulation ist die Fähigkeit, Zellflocken zu bilden, ein entscheidendes Merkmal für Industriehefe, das eine einfache Trennung von Zellen vom jungen Getränk ermöglicht. Um NCY in einen bestehenden Brauprozess zu implementieren, müssen diese Hefen an die aktuelle Brautechnik anpassbar sein. Daher wurden in dieser Arbeit die Flokkulations-Eigenschaften einer NCY Saccharomycopsis fermentans Hefe charakterisiert. Ich konnte zeigen, dass die Flokkulation von S. fermentans wie bei S. cerevisiae Ca2+ abhängig ist. Durch eine PacBio-Genomsequenzierung wurden, basierend auf der Ähnlichkeit mit den FLO1/5/9-Genen von S. cerevisiae und der ALS-Genfamilie von Candida albicans, 34 Flokkulationsgene in S. fermentans identifiziert und als FAS (für FLO/ALS-ähnliche Sequenzen) bezeichnet. Zudem wurde festgestellt, dass sich FAS-Gene in subtelomeren und telomeren Regionen befinden, ebenso wie die Flokkulationsgene von S. cerevisiae. "Telologe" - orthologe oder paraloge Gene, die sich an Telomeren befinden - war ein neuartiger Begriff, der eingeführt wurde, um Gene zu identifizieren, die einen evolutionär konservierten genomischen Ort teilen. N2 - SUMMARY Lager yeasts are hybrid organisms that originated by cell-fusion of two species of the genus Saccharomyces, S. cerevisiae and S. eubayanus. Post-hybridization events such as copy number variations (CNV), chromosome loss, reciprocal translocations or inter-chromosomal rearrangements can affect genome size, ploidy or sporulation efficiency. In polyploidy hybrids, the presence of multiple alleles of one gene complicates functional studies that rely on genome manipulation, e.g. gene deletions. Most yeast genetic engineering methods are based on the yeast homologous recombination (HR) machinery, which works excellently in S. cerevisiae but has a low efficiency in lager yeasts. In this thesis, I developed a strategy to improve the HR efficiency of lager yeast allowing short-flank (sf) PCR-based gene targeting. HR efficiency was successfully improved by overexpressing RAD51, which encodes a key regulator of the HR pathway that performs the search for complementary DNA strands during recombination. The successful improvement of sf PCR-based gene targeting in lager yeast was demonstrated by targeting the S. cerevisiae-derived loci of ADE2 and HSP104 in the allotetraploid lager yeast Weihenstephan 34/70. This technology can now be used to facilitate genetic engineering in lager yeast, e.g. by altering the expression of specific genes involved in wort fermentation and flavor production. Other mechanisms of genome evolution are by uptake of DNA through horizontal gene transfer or introgression. These were studied in more detail in a cider yeast strain. Genome sequencing revealed that the strain represents a particular Saccharomyces uvarum isolate. Interestingly, in this strain we identified the acquisition of ~100 kb of S. eubayanus DNA harboring 54 gene ORFs at chromosome XIV. An analysis based on DNA polymorphisms suggests that a lager yeast strain is likely parental donor of this DNA rather than a S. eubayanus strain. An additional DNA insertion with high identity to Torulaspora microellipsoides was found at chromosome XII. The introgression of this specific DNA region was previously observed in several wine yeast strains. It harbors 19 wine – related genes such as FOT1/FOT2, encoding the fungal oligopeptide transporter Fot, which confers advantages in nitrogen utilization. Strikingly, the S. uvarum cider isolate outcompetes in standard and cold fermentation regimes, S. cerevisiae EC1118, which is considered a workhorse of the wine industry. Beer and wine yeasts are characterized by their flocculation properties at the end of fermentation. Flocculation is the ability to produce cell-flocs, a critical trait for industrial yeast, which enables facile separation of cells from the green beer. To implement non-conventional yeast (NCY) in an existing brewing process, these yeasts need to be adaptable to the current brewing technology. Therefore, in this thesis, the flocculation properties of a NCY, Saccharomycopsis fermentans, were characterized. I could show that flocculation of S. fermentans is Ca2+- dependent like in S. cerevisiae. By PacBio genome sequencing, based on the similarity to the FLO1/5/9 genes of S. cerevisiae and the ALS gene family of Candida albicans, 34 flocculation genes were identified in S. fermentans, and termed FAS (for FLO/ALS-like sequences). Moreover, FAS genes are found to be located at sub telomeric and telomeric regions as are the S. cerevisiae flocculation genes. “Telologs” – orthologous or paralogous genes located at telomers – was a novel term introduced to identify genes which share an evolutionary conserved genomic location. KW - lager yeast KW - wine yeast KW - fermantation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:hebis:2083-366 N1 - Promotion unter internationaler, gemeinsamer Betreuung durch die Hochschule Geisenheim, Geisenheim, Deutschland und die Vrije Universiteit Brussel, Belgien, die zur Verleihung eines Doppelabschlusses führt. Abschluss der Hochschule Geisenheim University Doktorin der Agrarwissenschaften und Abschluss der VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL, Belgien Doctor of Bioengineering Sciences VL - 2021 PB - Gesellschaft zur Förderung der Hochschule Geisenheim CY - Geisenheim ET - 1. Auflage ER -