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Author

  • Bertram, Ralph (2)
  • Hillen, Wolfgang (1)
  • Kolb, Martina (1)

Year of publication

  • 2009 (1)
  • 2005 (1)

Document Type

  • Article (1)
  • Doctoral Thesis (1)

Language

  • German (1)
  • English (1)

Keywords

  • - (1)
  • Bacillus (1)
  • Bacillus subtilis (1)
  • Gene regulation (1)
  • Genregulation (1)
  • Site-specific recombination (1)
  • Tetracycline (1)
  • Tetracycline repressor (1)
  • Tn5 (1)
  • Transposon (1)
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Institute

  • Medizinische Fakultät -ohne weitere Spezifikation- (1)
  • Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation- (1)

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Genregulation in Bacillus subtilis durch neuartige integrative Elemente und Tet Repressor Varianten (2005)
Bertram, Ralph
TetR-basierte Transkriptionskontrolle ist eine in zahlreichen Organismen angewandte Methode zur konditionalen Genexpression. Der Anwendungsbereich des tet-Systems wurde durch Veränderungen des Regulators und dessen Liganden erweitert, indem TetR Varianten mit veränderter Induktor- oder Operatorerkennung generiert wurden (TetRi, TetRo), sowie Mutanten die eine Umkehrung der Aktivität aufweisen (TetRr). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob die beiden phänotypischen Aberationen einer veränderten Induktorspezifität und eines reversen Verhaltens innerhalb neu zu generierender TetRri Varianten funktionell vereint werden können. Hierzu wurden die Mutationen zwölf reverser TetR Varianten mit denen von TetRi1 (H64K S135L) kombiniert, welcher eine relaxierte Spezifität für das semisynthetische Tetrazyklinderivat 4-ddma-atc aufweist. Vier der kombinierten Regulatoren zeigten deutliche 4-ddma-atc vermittelte Korepression in vivo. Bei der Implementierung von sieben TetRr Mutationen in die exklusiv mit 4-ddma-atc induzierbare Variante TetRi2 (H64K S135L S138I), zeigte zunächst lediglich ein Vertreter moderate in vivo Korepression mit diesem Derivat. Jedoch wurde mit TetRri10 eine Variante mit einem deutlich ausgeprägten „ri“ Phänotyp konstruiert. Hierbei wurde festgestellt, dass die Mutation V99G zwar in Verbindung mit in TetRi2 reversen Phänotyp vermittelt, TetR V99G alleine jedoch nicht revers ist. Im Rahmen einer Mutationsanalyse wurde die Mutantenkombination H64K V99G S138I als ursächlich für den beobachteten Phänotyp von TetRri10 identifiziert. In einem zweiten Projekt wurden DNA Elemente entwickelt, mittels derer tet-regulierbare Auswärts-Promotoren Zielstellen-unspezifisch in das Genom von Bacillus subtilis eingebracht werden können. Der Grundaufbau dieser InsTetG+ genannten Elemente beinhaltet stromaufwärtige Translations- und Transkriptionsterminatoren, einen Kanamycin-Selektionsmarker, sowie einen divergent dazu angeordneten atc-sensitiven Pxyl/tet Promotor. Die Elemente InsTetG+1 und InsTetG+1a tragen den Regulator in cis codiert, so dass Ein-Schritt-Mutagenesen möglich sind. Da mit diesen Elementen lediglich moderate Regulationsfaktoren erreicht werden konnten, wurde InsTetG+2 konstruiert, welches kein tetR Gen trägt; stattdessen wird der Regulator episomal codiert. Dies resultierte sowohl mit wt-TetR als auch mit TetRr2 in effizienter Regulation. Zur Mobilisierung der InsTetG+-Sequenzen dienten flankierende „Mosaik Elemente“, welche Bindestellen für Tn5-Transposase darstellen. So war es möglich, in vitro assemblierte Transposomen, ternäre Transposase2-InsTetG+-Komplexe, durch Elektroporation in B. subtilis einzubringen. Im Rahmen einer Mutagenese von B. subtilis mit InsTetG+1 Transposomen wurden 387 Kandidaten erhalten und analysiert. Zwei Stämme wiesen atc-abhängige Auxotrophie auf, ein weiterer war regulierbar wuchsdefekt. Ein Ansatz einer InsTetG+2-Transposom-Mutagenese von B. subtilis/pWH119 lieferte etwa 1200 kanamycinresistente Kandidaten. Unter 432 analysierten Stämmen zeigten sechs regulierbare Wuchsdefizienz, während ein weiterer konditionale Auxotrophie aufwies. Da tetR in pWH119 einer PxylA Transkription unterliegt, war ein zusätzlicher Regulationsmodus möglich. So führte Xylose-Zugabe zu einer erhöhten TetR Expression, wodurch eine dichtere, jedoch voll atc-regulierbare Repression ermöglicht wurde. Mit hprK als Zielgen wurde demonstriert, dass InsTetG+ Elemente durch entsprechende Flankierung mit homologen Sequenzen auch ortsspezifisch in das B. subtilis Genom integrierbar sind. Bei drei verschieden regulierbaren hprK Stämmen konnte die Expression der codierten HPr- Kinase/Phosphorylase atc-abhängig moduliert werden.
In vivo Activation of Tetracycline Repressor by Cre/lox-Mediated Gene Assembly (2009)
Bertram, Ralph ; Kolb, Martina ; Hillen, Wolfgang
Tetracycline repressor (TetR) bears an unstructured loop region between helices _ 8 and _ 9, which is moderately permissive to amino acid exchanges and length variations. Recognition sites for the site-specific recombinases Flp ( FRT ) or Cre ( lox) were inserted in-frame into tetR , substituting some of this loop’s codons. A number of the deduced TetR variants displayed efficient regulation in vivo, thus allowing the establishment of a new mode of TetR activation on the genetic level. Chromosomally encoded tetR in Bacillus subtilis was disrupted and inactivated by insertion of a lox66 - aphAIII - lox71 kanamycin resistance cassette. Marker excision by Cre recombinase led to the assembly of a novel tetR allele. The encoded regulator, termed TetR lox72/1 , is distinguished from wt-TetR by a slightly elongated and altered _ 8– _ 9 loop only, harboring an amino acid stretch encoded by lox72 . Despite decreased intracellular protein amounts, TetR lox72/1 displayed efficient in vivo activity in B. subtilis and E. coli , indistinguishable from that of wt-TetR. These results underline the sequence flexibility of TetR in the _ 8- _ 9 loop and demonstrate the possible use of the regulator as a read-out tool for the activity of site-specific recombinases.
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