Intrinsic Flexibility and Structural Stability of Proteins

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2018-12-10
Issue Year
2018
Authors
Kahler, Anna
Editor
Abstract

The properties of a protein are based on its fold and thus, based on the sequence of the amino acids. Molecular and structural biology have provided a wealth of information about proteins, however, the underlying dynamical processes are not yet fully understood. In this context, molecular dynamics (MD) simulations represent a computational method that is capable to supplement experimental data by providing atomistic information on the dynamical behavior of proteins. This thesis illustrates how MD simulations can be applied to investigate biologically relevant proteins on the molecular level.

Transcription factors control the flow of genetic information from DNA to messenger RNA rendering understanding of their function highly important for the modulation and optimization of protein expression. The transcription factor RfaH from Escherichia coli consists of an N-terminal domain (NTD) and a C-terminal domain (CTD), which tightly interact in the autoinhibited conformation of RfaH. Upon activation, the CTD is released and undergoes a large-scale α → β structural transition. In the present work, investigation of RfaH under different environmental conditions revealed that not only high temperatures, but also a decrease in ionic strength significantly enhances CTD dynamics. Despite this enhanced dynamics, none of the conditions investigated caused CTD dissociation suggesting that this process needs to be triggered by the interaction with DNA or other proteins of the transcription machinery. Further, the N-terminus of the first CTD helix, which contains two glycines, was identified to exhibit rather large motions and a set of mutations is proposed affecting the local dynamics and/or the strength of the NTD–CTD interactions.

G-protein coupled receptors (GPCRs) interact with small molecules, peptides, or proteins and transmit a signal over the membrane via structural changes to activate intra-cellular pathways. GPCRs are characterized by a rather low sequence similarity and exhibit structural differences even for functionally closely related GPCRs. Here, a computational approach is proposed that relies on the generation of several independent models based on different template structures, which are subsequently refined by MD simulations. The conformational stability and the agreement with GPCR-typical structural features is then used to select a favorable model. This strategy was applied to predict the structure of the herpesviral chemokine receptor US28 by generating three independent models based on the known structures of the chemokine receptors CXCR1, CXCR4, and CCR5. Model refinement and evaluation suggested that the GPCR-typical structural features, such as a conserved water cluster or conserved non-covalent contacts, are present to a larger extent in the model based on CCR5 compared to the other models. A final model validation based on the recently published US28 crystal structure confirms that the CCR5-based model is the most accurate and exhibits 80.8 % correctly modeled residues within the transmembrane helices. The same modeling strategy was used to investigate the structure for the herpesviral chemokine receptor US27; refinement and evaluation of the models suggested that the model based on CXCR4 exhibits more GPCR-typical structural features than the other models. This favorable model for US27 was afterwards used to elucidate the interface of US27 and the CXCR4. The data suggest that the interaction between the heterodimer is stronger than in the CXCR4–CXCR4 homodimer which is in line with previous research that strong host-pathogen interaction are required to interfere with host signaling processes.

Abstract

Die Eigenschaften von Proteinen basieren auf deren Faltung und sind somit durch die Abfolge der Aminosäuren bestimmt. Molekular- und Strukturbiologie liefern eine Fülle an Informationen über Proteine, dennoch sind die zugrundeliegenden dynamischen Prozesse bisher nicht vollständig verstan- den. Zusätzlich zu experimentellen Daten können Moleküldynamik (MD)-Simulationen genutzt werden, um Informationen über Proteindynamik auf atomarer Ebene zu gewinnen. Die vorliegende Arbeit legt dar, wie MD-Simulationen dabei helfen können, biologisch relevante Proteine auf molekularer Ebene zu untersuchen.

Transkriptionsfaktoren kontrollieren den Fluss genetischer Information von DNA zu RNA, weshalb es wichtig ist deren Einfluss auf die Protein- expression zu verstehen. Der Transkriptionsfaktor RfaH aus Escherichia coli besteht aus einer N-terminalen Domäne (NTD) und einer C-terminalen Domäne (CTD). Diese beiden Domänen wechselwirken innerhalb des Proteins miteinander, wodurch sich das Protein selbst inhibiert. Wird es aktiviert, lockert sich die Bindung zwischen NTD und CTD, und die CTD durchläuft nach vollständiger Ablösung eine große α → β-Umlagerung. Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass nicht nur höhere Temperaturen, sondern auch niedrigere Ionenstärke diese Dynamik der CTD verstärken können. Dennoch konnte keine der in dieser Arbeit untersuch- ten Umgebungsbedingungen die vollständige Ablösung hervorrufen, was nahelegt, dass dieser Ablöseprozess durch Wechselwirkung mit DNA oder anderen Transkriptionsproteinen herbeigeführt werden muss. Desweitern wurden größere Bewegungen im N-terminalen Teil der ersten CTD-Helix beobachtet. Dieser Teil der Helix enthält zwei Glycine, für die Mutationen vorgeschlagen wurden, die die lokale Dynamik und/oder die Stärke der NTD–CTD-Wechselwirkung beeinflussen.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) können Signalwege innerhalb der Zelle aktivieren, indem sie, ausgelöst durch die Bindung eines kleinen Moleküls, eines Peptids oder Proteins, mit Hilfe einer strukturellen Umlagerung ein Signal über die Membran weitergeben. Untereinander haben GPCRs eine eher geringe Sequenzähnlichkeit und selbst funktionell nahe verwandte GPCRs weisen gewisse strukturelle Unterschiede auf. In dieser Arbeit wird eine Herangehensweise vorgeschlagen, bei der mehrere unabhängige Strukturmodelle auf Basis verschiedener Vorlagen erstellt und mit MD-Simulationen verfeinert werden. Das bevorzugte Proteinmodell wird anschließend anhand seiner konformationellen Stabilität und seiner Übereinstimmung mit GPCR-typischen strukturellen Eigenschaften identifiziert. Als Test wurden drei unabhängige Modelle des herpesviralen Chemokinrezeptors US28 erzeugt, die auf den Chemokinrezeptoren CXCR1, CXCR4 und CCR5 basieren. Aus den Simulationen geht hervor, dass das Modell auf CCR5-Basis mehr GPCR-typische Merkmale aufweist als die anderen Modelle. Letztendlich konnte ein Vergleich zwischen den Modellen für US28 und der kürzlich veröffentlichten Kristallstruktur von US28 bestätigen, dass das Modell auf CCR5-Basis den meisten Kriterien entspricht und 80.8 % der Reste innerhalb der Transmembranregion richtig modelliert wurden. Die gleiche Herangehensweise wurde auch für die strukturelle Untersuchung des herpesviralen Chemokinrezeptor US27 gewählt. Das Modell, das auf CXCR4 basiert, weist die meisten GPCR-typischen Merkmale auf und wurde anschließend genutzt, um die Wechselwirkung zwischen US27 und CXCR4 zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wechselwirkung im Heterodimer stärker ist als im CXCR4-Homodimer, was zu früheren Untersuchungen passt, dass eine starke Wirt-Pathogen-Interaktion notwendig ist, um mit zellulären Prozessen zu interferieren.

DOI
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