Identifizierung, Charakterisierung und Optimierung von neuen kovalenten Split-Isopeptid Systemen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2018-04-16
Issue Year
2018
Authors
Pröschel, Marlene
Editor
Abstract

The discovery of unprecedented intramolecular isopeptide bonds within immunoglobulin-like domains of adhesive extracellular proteins from gram-positive bacteria has revolutionized Biotechnology and Synthetic Biology. The protein superglue system, comprising of the protein SpyCatcher and its specific peptide partner SpyTag, is based on the splitting of the CnaB2 domain of the fibronectin-binding protein from Streptococcus pyogenes and is a convenient and widely used molecular tool for any kind of bioconjugation. The SpyCatcher-SpyTag mediated post-translational control over proteins (protein-coupling, protein-immobilization, functionalization of materials) benefits from the covalent, irreversible, stable, specific and robust character of the genetically encoded reaction partners, Catcher and Tag, that efficiently interact to form an autocatalytic isopeptide bond. To extend and improve the functional potential of this technology, especially by making it more controllable and programmable, the focus of this work was to identify, characterize and optimize new Catcher-Tag systems based on isopeptide bonds. By structure-based data base search within cell surface proteins from gram-positive bacteria consisting of Ig-like domains of the CnaB-folding type four potential split-domain candidates were selected and subjected to further detailed investigation. Based on in silico analyses, the CnaB domain splitting, which results in one Catcher protein and one Tag peptide, was performed. Subsequent in vitro split-domain reconstitution experiments to test for the underlying isopeptide bond formation were carried out. Two out of the four CnaB domain candidates, 4oq1 and 3kptC, turned out to be functional split-isopeptide systems. The 4oq1Catcher-4oq1Tag system is based on the D2 domain of the basal pilin RrgC from Streptococcus pneumoniae, while the 3kptCCatcher-3kptCTag system is derived from the CNA3 domain of the major pilin BcpA from Bacillus cereus. After the identification, the new Catcher-Tag systems were further characterized. Verification of the isopeptide triad, analysis of the efficiency and specificity of the Catcher-Tag systems were followed by identifying the optimal reaction conditions (optimal Catcher-Tag ratio, chemical additives, optimal temperature and pH). Compared to the established, very efficient SpyCatcher-SpyTag system the newly identified Catcher-Tag systems are relatively slow and inefficient with respect to isopeptide bond formation. Under optimal conditions the reactivity of the systems was already improved significantly. To further increase the reaction efficiency between respective Catcher and Tag reaction partners different protein engineering strategies to genetically manipulate the protein components were applied. To analyse the initial products of CnaB domain splitting first, N- and C-terminally modified protein variants were tested for improved reconstitution efficiency. Essential as well as dispensable amino acids for the reaction were identified. Various rational mutagenesis design strategies, especially to improve protein stability of the bigger Catcher proteins, were applied next. Just a few mutations were identified that could improve the covalent reaction between Catcher and Tag, whereas most of the mutations did not affect the reaction at all or made it even worse. This clearly shows the complexity of protein engineering. The SpyCatcher-SpyTag as well as the 4oq1Catcher-4oq1Tag system were proven to be functional in plants and therefore a first plant biotechnological application (isolation of chloroplasts) of these covalent Catcher-Tag systems was tested. Based on some pre-experiments (generation of a white trimer for BioLED applications, SpyCatcher- or SpyTag-functionalized magnetic beads) new future applications of these Catcher-Tag systems were discussed. The Catcher-Tag systems discovered in this thesis enlarge the toolbox of convenient molecular devices for irreversible, post-translational control over proteins and open up new opportunities, also in plant biotechnology.

Abstract

Die überraschende Neuentdeckung intramolekularer Isopeptidbindungen innerhalb Immunglobulin-ähnlicher Domänen von adhäsiven, extrazellulären Proteinen gram-positiver Bakterien hat die Biotechnologie und Synthetische Biologie revolutioniert. Das aus der Spaltung der CnaB2-Domäne des Fibronektinbindeproteins von Streptococcus pyogenes resultierende ,,Superkleber”-System, bestehend aus dem Protein SpyCatcher und seinem spezifischen Peptidpartner SpyTag, ist ein häufig und vielfältig verwendetes molekulares Werkzeug für Biokonjugationen. Die über dieses SpyCatcher-SpyTag System vermittelte post-translationale Kontrolle über Proteine (Verknüpfung und Immobilisierung von Proteinen, Funktionalisierung von Materialien) profitiert dabei von dem kovalenten, irreversiblen, stabilen, spezifischen und robusten Charakter der genetisch kodierten Catcher-Tag Reaktionspartner, die unter Ausbildung einer autokatalytischen Isopeptidbindung sehr effizient miteinander reagieren. Um die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technologie vor allem durch Programmierbarkeit und Kontrollierbarkeit zu erweitern und zu verbessern, wurden in dieser Arbeit alternative, neue Catcher-Tag Systeme, basierend auf Isopeptidbindungen, identifiziert, charakterisiert und optimiert. Über strukturbasierte Datenbanksuche innerhalb von Zelloberflächenproteinen gram-positiver Bakterien, die aus Ig-ähnlichen Domänen des CnaB-Typs aufgebaut sind, wurden vier potentielle Split-Domänen Kandidaten für genauere Analysen ausgewählt. Die CnaB-Domänen wurden mittels in silico Analysen in zwei Teile, Catcher-Protein und Tag-Peptid, gespalten und anschließend in vitro bezüglich ihrer Fähigkeit zur Split-Domänen Rekonstitution, unter Ausbildung einer intermolekularen Isopeptidbindung, analysiert. Zwei der vier CnaB-Kandidatendomänen, 4oq1 und 3kptC, konnten in dieser Arbeit mittels Rekonstitutionsexperimenten erfolgreich als neue Split-Isopeptid Systeme identifiziert werden. Das 4oq1Catcher-4oq1Tag System basiert auf der D2-Domäne des basalen Pilins RrgC von Streptococcus pneumoniae, während sich das 3kptCCatcher-3kptCTag System von der CNA3-Domäne des Hauptpilins BcpA von Bacillus cereus ableitet. An die Identifizierung schloss sich die genauere Charakterisierung der neuen Catcher-Tag Systeme an. Nach der Verifizierung der Isopeptid-Triade, der Analyse der Rekonstitutionseffizienz und Orthogonalitätstests der neuen Catcher-Tag Systeme, wurden die optimalen Reaktionsbedingungen (optimales Catcher-Tag Verhältnis, Testen bestimmter chemischer Zusätze, Temperatur- und pH-Optimum) ermittelt. Deutlich wurde, dass die neu identifizierten Catcher-Tag Systeme relativ langsam und ineffizient waren, vor allem im direkten Vergleich mit dem hocheffizienten SpyCatcher-SpyTag System. Unter optimalen Bedingungen konnte die Reaktivität der Systeme bereits deutlich verbessert werden. Um die Effizienz der kovalenten Reaktion zwischen entsprechenden Catcher- und Tag-Reaktionspartnern weiter zu optimieren, wurden verschiedene Strategien des ,,Protein Engineerings” angewendet und die Proteinkomponenten genetisch manipuliert. Zuerst wurden die initialen Produkte der CnaB-Domänenspaltungen überprüft, indem N- und C-terminale Proteinvarianten im Hinblick auf eine verbesserte Rekonstitutionseffizienz getestet wurden. Sowohl essentielle als auch für die Reaktion verzichtbare Aminosäuren konnten dadurch identifiziert werden. Vielfältige rationale Mutagenese-Strategien, vor allem zur Stabilisierung der größeren Catcher-Proteine durch gezielte Aminosäuresubstitutionen, folgten. Einige, wenige Mutationen konnten die kovalente Reaktion zwischen Catcher und Tag verbessern, wohingegen die meisten Mutationen keine Verbesserung oder sogar eine Verschlechterung der Rekonstitutionseffizienz mit sich brachten, was die Komplexität des ,,Protein Engineerings” verdeutlicht. Nach Bestätigung der Funktionalität des SpyCatcher-SpyTag Systems und des 4oq1Catcher-4oq1Tag Systems in planta, wurde eine erste pflanzenbiotechnologische Anwendung (Chloroplasten-Isolierung) dieser kovalenten Catcher-Tag Systeme getestet. Mögliche andere und neue Anwendungen der Catcher-Tag Systeme wurden, basierend auf ersten Vorexperimenten (Herstellung eines weißen Trimers für BioLED-Anwendungen, SpyCatcher- oder SpyTag-funktionalisierte Magnetpartikel), diskutiert. Die in dieser Arbeit erforschten Catcher-Tag Systeme erweitern somit das Repertoire an nützlichen, vielseitig einsetzbaren molekularen Werkzeugen zur irreversiblen, post-translationalen Kontrolle über Proteine und eröffnen neue Anwendungsmöglichkeiten, auch in der Pflanzenbiotechnologie.

DOI
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