Identification of compatibility factors in the maize – Colletotrichum graminicola interaction

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2017-09-15
Issue Year
2017
Authors
Voitsik, Anna Maria
Editor
Abstract

Colletotrichum graminicola is a phytopathogenic fungus causing anthracnose disease of maize. It exhibits a hemibiotrophic lifestyle, combining bio- and necrotrophy. The fungus spreads from plant to plant by rain-swept conidia. Once conidia get in contact with plant surface, they germinate and form appressoria, specialised structures to penetrate into the host tissue, in which biotrophic primary hyphae are developed. Approximately 3 days post inoculation, fungus switches to the necrotrophic phase and starts to produce invasive secondary hyphae that destroy the host tissue, which leads to development of lesions and rapid disease progress. Anthracnose leads to severe yield losses in various predominantly tropical and subtropical crop plants and thus, understanding the mechanisms underlying the development of this disease has economical impact. One major research target is to identify compatibility factors in host and the pathogen that play a crucial role for the specific interaction. In the frame of this thesis, compatibility factors in the maize - C. graminicola interaction were identified by combined maize transcriptome-metabolome analysis and analysis of C. graminicola mutants exhibiting reduced virulence. Maize microarray hybridisation revealed that transcripts of two NAC transcription factors, ZmNAC41 and ZmNAC100, accumulated in leaves infected with C. graminicola, compared to mock-treated leaves. Further experiments with wild type CgM2 and mutant strains of C. graminicola showed that the expression of both NACs positively correlated with the pathogenicity of the fungus and that induction of ZmNAC41occured already at pre-penetrations stage, while ZmNAC100 was induced solely upon successful penetration. Moreover, both genes were responsive to jasmonic acid treatment and transcripts of both genes accumulated also in senescing leaves. It can be assumed that ZmNAC41 and ZmNAC100 are new defence-associated maize NACs, that may possibly also play a role during leaf senescence and thus, might link defence and senescence signaling pathways. A phylogenetic classification, including identification of conserved protein motifs and promoter elements, of all maize NAC transcription factors present in the first complete assembly of the maize genome revealed that ZmNAC41 and ZmNAC100 are most related to NACs that are associated with defence responses. The initial microarray experiment also showed that two alternative oxidases (AOX2 and AOX3) are induced in C. graminicola-infected maize leaves. AOX3 transcript accumulated already during pre-penetration phase but the induction of AOX3 was much higher upon penetration. Infection experiments with C. graminicola pathogenicity mutants showed a positive correlation of AOX3 transcript amount with pathogenicity of the fungal strain. AOX3 responded to treatment with jasmonic acid and salicylic acid analogues, mimicking hormones regulating the plant defence response. Treatment with inhibitors of AOX restricted C. graminicola growth on planta, but as mutant maize plant lacking AOX could not be generated, it was not possible to assess the effect of AOX deletion on infection. Further research focused on the effect of AOX genes on the Arabidopsis thaliana - Colletotrichum higginsianum interaction which revealed that susceptibility of Arabidopsis could not be linked to expression level of Aox1a, which is a main leaf isoform. Based on the presented data, it cannot be resolved if alternative oxidase is induced as a part of host defence or if C. graminicola actively up-regulates AOX to attenuate reactive oxygen species (ROS) production and subsequent ROS-mediated defence responses in the host. In a second part of this thesis, a re-screening of a C. graminicola T-DNA insertion mutant collection for weak phenotypes led to identification of five novel C. graminicola mutants affected in pathogenicity. One insertion mutant allowed the identification of the novel compatibility factor, ubiquitin-conjugating enzyme 8 (CgUbc8). CgUbc8 knock-out strains exhibited reduced virulence due to diminished appressoria melanisation and penetration rate. The accumulation of glycogen in conidia of insertion mutant and CgUbc8 knock-out strains was decreased. Subsequent analysis of glycolytic and gluconeogenetic enzyme activities in C. graminicola revealed that glucose degradation via glycolysis might be up-regulated in conidia of insertion mutant and CgUbc8 knock-out strains compared to wild type CgM2. Moreover, lower activity of malate dehydrogenase, a target of carbon catabolite repression (CCR) in strains lacking CgUbc8 suggested that CgUbc8 might be involved in regulation of CCR in C. graminicola. The experimental evidence however, still needs to be provided.

Abstract

Colletotrichum graminicola ist ein phytopathogener Pilz, der Anthraknose auf Mais verursacht. Der Pilz weist einen hemibiotrophen Lebensstil auf, der aus einer initialen biotrophen und einer darauf folgenden nekrotrophen Phase besteht. Konidien von C. graminicola werden durch Regentropfen verbreitet, keimen nach dem Kontakt mit der Pflanzenoberfläche aus und bilden Appressorien, spezialisierte Penetrationsorgane, die in das Wirtsgewebe eindringen und biotrophe primäre Hyphen in den infizierten Zellen ausbilden. Etwa drei Tage nach Inokulation wechselt der Pilz zur nekrotrophen Phase und beginnt invasive sekundäre Hyphen zu bilden, die das Wirtsgewebe zerstören, was zur rapiden Entstehung von Läsionen als Anthraknosesymptomen führt. Da die Anthraknose starke Ertragsverluste an vor allem tropischen Nutzpflanzen verursacht, ist es aus ökonomischen Gründen wichtig, die Mechanismen zu verstehen, die zur Krankheitsentwicklung führen. Eine zentrale Strategie in der Untersuchung von Pflanzen-Pathogen-Interaktionen ist Identifizierung von Kompatibilitätsfaktoren in Pathogen und Wirt, die entscheidende Rollen für den Ausgang der Interaktion spielen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Kompatibilitätsfaktoren in der Interaktion von Mais und C. graminicola identifiziert, zum einen mithilfe von kombinierter Transkriptom - Metabolom Analyse, zum anderen durch die Untersuchung von C. graminicola-Pathogenitätsmutanten. Hybridisierungsexperimente mit Mais-Microarrays zeigten, dass Transkripte von zwei NAC Transkriptionsfaktoren, ZmNAC 41 and ZmNAC100, in C.graminicola-infizierten Blättern im Vergleich zur Kontrollblättern akkumulierten. Durch Infektionsexperimente mit Wildtyp CgM2 und C. graminicola-Pathogenitätsmutanten stellte sich heraus, dass das Expressionsniveau beider NACs positiv mit der Pathogenität des verwendeten Pilzstammes korrelierte und dass die Induktion von ZmNAC41 bereits während der Prä-Penetrationsphase, die Induktion von ZmNAC100 ausschließlich nach erfolgreicher Penetration stattfand. Außerdem akkumulierten Transkripte von beiden Genen in seneszenten Blättern und nach Behandlung mit Jasmonat. Es kann daher angenommen werden, dass mit ZmNAC41 und ZmNAC100 neue Abwehr-assoziierte NACs aus Mais identifiziert werden konnten, die vermutlich auch in Seneszenz involviert sind und somit als Bindeglied zwischen der Abwehr- und Seneszenz-Signalwegen verstanden werden können. Die im Rahmen dieser Arbeit geleistete phylogenetische Klassifizierung aller Mais-NAC-Transkriptionsfaktoren auf Basis der aktuellen Annotation des Maisgenoms konnte zeigen, dass ZmNAC41 und ZmNAC100 die stärkste Verwandtschaft zu solchen NAC-Transkriptionsfaktoren aufweist, die beschriebenermassen eine Rolle in der pflanzlichen Abwehr spielen. Das zu Beginn der Arbeit durchgeführte Microarray-Experiment zeigte ferner, dass zwei Alternative Oxidasen (AOX2 und AOX3) in C. graminicola-infizierten Blättern induziert werden. Transkripte von AOX3 akkumulierten bereits während der Prä-Penetrationsphase, die transkriptionelle Induktion von AOX3 stieg jedoch nach der Penetration noch deutlich weiter an. Infektionsexperimente mit C. graminicola Wildtyp CgM2 und Pathogenitätsmutanten zeigten eine positive Korrelation der AOX3-Transkriptmenge mit der Pathogenität des Pilzes. Das AOX3-Gen wurde außerdem durch die Behandlung mit Jasmon- und Salicylsäure- Analoga induziert, die pflanzliche Abwehr regulieren. Behandlung mit Inhibitoren der Alternativen Oxidase hemmte das Wachstum von C. graminicola in planta. Allerdings war es nicht möglich, der Einfluss einer AOX-Deletion auf den Infektionsverlauf zu evaluieren, da Mais-Mutanten mit fehlender AOX nicht verfügbar waren. Weitere Untersuchungen fokussierten sich daher auf den Einfluss von AOX auf die Interaktion von Arabidopsis thaliana mit dem verwandten Pathogen Colletotrichum higginsianum, da hier beide Interaktionspartner genetisch zugänglich sind. Die Experimente zeigten jedoch dass die Expression des Aox1a-Genes, der wichtigsten AOX-Isoform in Blättern, nicht mit der Suszeptibilität von Arabidopsis korrelierte. Auf Basis der durchgeführten Experimente kann nicht abschließend bewertet werden, ob die Alternative Oxidase ein Bestandteil der Wirtsabwehr ist, oder ob C. graminicola die AOX-Expression aktiv hochreguliert, um die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (RSS) und die darauffolgende RSS-abhängige Abwehr abzuschwächen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit konnten fünf neue Mutanten mit nur schwach beeinträchtigter Pathogenität aus einer Kollektion von C. graminicola-T-DNA-Insertionsmutanten isoliert werden. Anhand von Untersuchungen an einer dieser C. graminicola-Pathogenitätsmutanten konnte ein weiterer Kompatibilitätsfaktor identifiziert werden, das Ubiquitin-konjugierende Enzym 8 (Ubc8). Die Insertionsmutante und die darauffolgend hergestellte CgUbc8-Deletionsmutante zeigten verminderte Virulenz aufgrund einer verringerten Melanisations- und Penetrationsrate. Der Glykogeninhalt in Konidien von CgUbc8-Deletions- und Insertionsmutanten war verringert. Die Analyse von glykolytischen und glukoneogenetischen Enzymaktivitäten in C. graminicola-Konidien zeigte dass der glykolytische Glukoseabbau in Insertion- und CgUbc8 Deletionsmutanten hochreguliert sein könnte. Ferner wurde in C. graminicola-Stämmen mit fehlender Ubc8 eine niedrigere Aktivität der Malatdehydrogenase beobachtet. Dies kann darauf hindeuten dass CgUbc8 in der Steuerung der Katabolitrepression von C. graminicola (eng. Carbon Catabolite Repression = CCR) beteiligt ist, da Malatdehydrogense durch CCR reguliert ist. Die Vermutung bedarf noch der experimentellen Überprüfung.

DOI
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