Der molekulare Transformationsmechanismus der MLL-Fusionsproteine

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2009-05-12
Issue Year
2009
Authors
Müller, Dorothee
Editor
Abstract

Chromosomal aberrations at the MLL locus 11q23 create chimeric MLL fusions proteins. These code for aberrant transcription factors that upregulate expression of A cluster hox genes eventually causing acute leukemia. Intriguingly, it has been suggested that several MLL fusion partners might be associated with transcriptional elongation. Therefore, we hypothesized that at least some MLL fusion partners could be members of an yet unknown elongation complex. To investigate this hypothesis further, an ENL associated protein complex (EAP, ENL associated Proteins) was purified which consists of (1) MLL fusion partners (AF4, AF5q31, LAF4), (2) polycomb group members (CBX8, BCoR, RING1) and (3) enzymatic activities playing a role in transcriptional elongation (pTEFb, DOT1L). By using co-immunoprecipitation and GST-pulldown assays the composition of EAP was confirmed and verified. Further in vitro analyses revealed that EAP mediates both H3K79 dimethylation and phosphorylation of the C-terminal domain of RNA polymerase II. In vivo knockdown studies provided evidence that EAP is involved in global transcriptional elongation as well as in global H3K79 dimethylation. Additionally, EAP regulates the HOXA9 gene and transactivates promotors. Thus, EAP is necessary for efficient transcription. To further characterize the elongation activity of MLL fusion partners per se and in the context of MLL fusions co-immunoprecipitations and a “Rev elongation assay” were performed. These experiments demonstrated that the fusion partners ENL, AF5q31 and AF4 not only affect elongation by recruiting pTEFb, but also that EAP intracomplex interactions are conserved in the fusion situation. Notably, deletion mutants of fusion partners that cannot recruit pTEFb did not transform. In agreement with this finding MLL-ENL transformed cells were sensitive to the pTEFb inhibitor flavopiridol. Chromatin immunoprecipitations on Hoxa9 indicate that H3K79 dimethylation might be a prerequisite for productive elongation. In summary, these data support the original hypothesis that mistargeting of EAP function via MLL fusions leads to ectopic expression of normal MLL targets and therefore EAP is essential for leukemogenesis. Hence, EAP members like pTEFb and DOT1L could present attractive targets for future therapy.

Abstract

Chromosomale Aberrationen am MLL-Locus 11q23 führen zu chimären MLL-Fusionsproteinen. Diese kodieren für aberrante Transkriptionsfaktoren, die die Expression von „A Cluster“ Hox-Genen hochregulieren und infolge dessen akute Leukämien verursachen. Frühere Befunde deuteten an, daß mit MLL fusionierte Proteine mit der transkiptionellen Elongation im Zusammenhang stehen könnten. Zur weiteren Aufklärung dieser Hypothese wurde in dieser Promotionsarbeit ein neuartiger Komplex (EAP, ENL-assoziierte Proteine) aufgereinigt, der neben MLL-Fusionspartnern (AF4, AF5q31, LAF4) und Polycomb-Gruppen-Proteinen (CBX8, BCOR, RING1) auch enzymatische Aktivitäten (pTEFb und DOT1L) enthält, die an der transkriptionellen Elongation beteiligt sind. In Koimmunopräzipitationen und GST-Pulldown Experimenten wurde die Zusammensetzung EAPs bestätigt und näher bestimmt. Desweiteren belegten in vitro Analysen, daß EAP sowohl die H3K79-Dimethylierung als auch die Phosphorylierung der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II vermittelt. Darüberhinaus erbrachten in vivo Knockdown-Studien den Nachweis, daß EAP an der globalen transkriptionellen Elongation und H3K79-Dimethylierung beteiligt ist. Außerdem spielt EAP eine Rolle bei der HOXA9 Genregulation und der Transaktivierung von Promotoren. Um die Stimulierung von Elongationsaktivität durch MLL-Fusionsproteine per se und im Kontext mit MLL-Fusionen näher zu charakterisieren, wurden Koimmunopräzipitationen und ein „Rev-Elongations-Experiment“ durchgeführt. Tatsächlich sind ENL, AF5q31 und AF4 in der Lage, die Elongation durch Rekrutierung von pTEFb zu beeinflussen. Außerdem waren Interaktionen zwischen EAP-Mitgliedern auch in der Fusionssituation konserviert. Interessanterweise verloren Deletionsmutanten, die nicht mehr pTEFb rekrutieren, ihr Transformationspotential. Damit übereinstimmend waren MLL-ENL transformierte Zellinien sensitiv gegenüber dem pTEFb-Inhibitor Flavopiridol. Chromatin-Immunopräzipitationen auf dem Hoxa9-Locus wiesen zudem darauf hin, daß H3K79-Dimethylierung eine Vorraussetzung für die produktive Elongation sein könnte. Zusammengefaßt untermauern diese Ergebnisse die Hypothese, daß die Rekrutierung von EAP über den MLL-Fusionspartner zur ektopen Expression von MLL-Zielgenen führt und somit essentiell für die Leukämogenese ist. EAP Mitglieder wie pTEFb oder DOT1L könnten daher attraktive Ziele für zukünftige neue Medikamente im Kampf gegen Leukämie darstellen.

DOI
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