Hsc70 Regulates Intercellular Transfer of Y-Chromosome Antigen DBY via Microvesicles

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2017-05-08
Issue Year
2017
Authors
Kretschmann, Sascha
Editor
Abstract

Recent studies have demonstrated that CD4 T lymphocytes (T cells) can efficiently reject major histocompatibility complex (MHC) class II-negative tumors in vivo. This requires presentation of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells, but the mechanism of intercellular antigen transfer is poorly understood. We hypothesized that intercellular transfer of proteins is not the sole consequence of cell death-mediated protein release but requires an active transfer which depends on KFERQ-like binding motifs on target proteins and the process of microautophagy. To prove this, we used the human Y-chromosome antigen DBY as a model-antigen and identified two putative KFERQ-like motifs. We found that mutation of the first KFERQ-like motif significantly impaired indirect T cell recognition. Moreover, indirect recognition was completely abolished when the peptide was truncated and only encoded the DBY epitope, indicating additional regulatory elements located outside of the T cell epitope are required. Also, we provide evidence that indirect presentation of DBY relies on protein-protein interaction between DBY and heat shock cognate protein 70 and that intercellular transfer is mediated via CD63-positive exosomes. Our data indicate that indirect recognition of tumor-associated antigens on surrounding antigen-presenting cells requires an active process of antigen transfer. Furthermore, by screening a random mutagenesis library, we obtained preliminary data that an additional protein-site in DBY might be important for the selective antigen transfer. Finally, to demonstrate the in vivo relevance of this mechanism, a mouse model of MHC class II-negative tumor rejection was successfully established.

Abstract

Aktuelle Forschungen haben gezeigt, dass CD4 T-Lymphozyten (T-Zellen) Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II-negative Tumore in vivo effizient abstoßen können. Dieses Ereignis setzt jedoch die Präsentation von tumor-assoziierten Antigenen auf umliegenden Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) voraus, wobei der Mechanismus des interzellulären Antigentransfers weitestgehend unverstanden ist. Möglichkeiten der unkontrollierten Antigenfreisetzung sind beispielsweise durch nekrotische Zellen aber auch nach externen Eingriffen, wie durch Strahlentherapien, gegeben. Im Gegensatz dazu bildet die zellvermittelte Absonderung membranumhüllter Vesikel eine Quelle kontrollierter Antigenfreisetzung. Insbesondere Exosomen gelten dabei als wichtige, interzelluläre Kommunikationsvehikel von denen bekannt ist, dass sie Nukleinsäuren, Lipide und Proteine transportieren. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass zytosolische Proteine durch das artverwandte Hitzeschockprotein 70 (hsc70) zu intraluminalen Vesikeln des späten Endosoms transportiert werden können. Mechanistisch geschieht dies durch einen mikroautophagie-ähnlichen Signalweg, bei dem die Erkennung sogenannter KFERQ-like Signalmotive auf Zielproteinen von entscheidender Bedeutung ist. Die vorliegende Arbeit hat den Fokus, den Mechanismus des interzellulären Antigentransfers zu charakterisieren. Dabei wurde die Hypothese aufgestellt, dass dem interzellulären Antigentransfer ein aktiver Transport zugrunde liegt, welcher mechanistisch durch hsc70 und in mikroautophagie-ähnlicher Art und Weise vermittelt wird. Um dieser Annahme nachzugehen, wurden zunächst Tumorzelllinien generiert, die mit dem vollständigen humanen Y-Chromosom Antigen DBY, dessen X-Chromosom Homolog DBX, dem CD4 T-Zellepitop von DBY (Polypeptid, DBY 25-mer) und dem vollständigem DBY mit Mutationen (in jeweils einer oder beiden putativen hsc70 Bindungsstellen) transduziert wurden. Nach interzellulärem Transfer konnte eine T-Zellaktivierung für das vollständige DBY und für eine der beiden Einzelmutanten gemessen werden. Hingegen war die T-Zellerkennung der anderen Einzelmutante und der Doppelmutante signifikant reduziert, sowie im Falle des DBY 25-mers sogar vollständig abwesend. Weitere Untersuchungen, die mit Hilfe eines Immunassays durchgeführt wurden, ergaben, dass die Protein-Protein Interaktion zwischen hsc70 und der sensitiven DBY Einzelmutante deutlich reduziert war, während keine Interaktion mit dem kurzen DBY 25-mer beobachtet wurde. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass der interzelluläre Antigentransfer spezifisch reguliert werden kann, wobei hsc70, wie initial vermutet, eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Da es nach Übertragung von Kulturüberständen transgenpositiver HeLa-Zellen auf Antigennegative APZ zur T-Zellaktivierung kam, konnte gezeigt werden, dass es sich um einen zellkontaktunabhängigen Transfer des Antigens handelte. Darüber hinaus zeigte eine elektronenmikroskopische Untersuchung der transduzierten Zellen eine Assoziation von DBY mit dem exosomen-assoziierten Tetraspanin-30 (CD63). Um dies im Detail zu analysieren, wurden Exosomen aus Zellkulturüberständen transgenpositiver HeLa-Zellen mittels differentieller Ultrazentrifugation aufgereinigt und auf antigennegative APZ übertragen, um anschließend die T-Zellerkennung zu untersuchen. Dabei fiel auf, dass das vollständige DBY den T-Zellklon aktivieren konnte, während die sensitive DBY Mutante eine deutlich reduzierte T-Zellerkennung aufwies und das DBY 25-mer wiederum nicht zur T-Zellaktivierung führte. Außerdem konnte das vollständige DBY in isolierten CD63-positiven Exosomen auf Proteinebene nachgewiesen werden. Diese Daten zeigen, dass die indirekte Erkennung von tumor-assoziierten Antigenen auf umliegenden APZ das Ergebnis eines aktiven Antigentransfers via sezernierte Mikrovesikel sein kann. Da die Mutation der putativen hsc70 Bindungsstellen jedoch nur zu einer Reduktion des interzellulären Transfers und nicht zu einer vollständigen Blockade führten, wurden Klonbibliotheken mit mutierten DBY Konstrukten zur Identifikation weiterer regulatorischer Elemente generiert. Interessanterweise wiesen die Daten darauf hin, dass der selektive Antigentransfer von DBY durch eine weitere Stelle in der Proteinsequenz reguliert sein könnte. Um diesbezüglich genauere Aussagen treffen zu können, werden künftig weitere Untersuchungen durchgeführt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von hsc70 an putative KFERQ-like Motive in der Proteinsequenz des humanen DBY mit dem interzellulären Transfer korreliert. Die in dieser Forschungsarbeit erhobenen Daten weisen außerdem darauf hin, dass die interzelluläre Übertragung von DBY spezifisch durch sekretierte, CD63-positive Exosomen erfolgt. Diese Ergebnisse stellen hsc70 als möglichen Regulator für den interzellulären Antigentransfer bestimmter zytosolischer Proteine dar. Um die in vivo Relevanz des hier beschriebenen Mechanismus beantworten zu können, wurde im abschließenden Teil dieser Arbeit ein Mausmodell zur Untersuchung der Abstoßung von MHC Klasse II-negativen Tumoren etabliert. Künftige Forschungsarbeiten werden sich daher mit der in vivo Immunantwort beschäftigen, um den Einfluss der Bindung von hsc70 an tumor-assoziierte Antigene bei der Eradikation von MHC Klasse II-negativen Tumoren beurteilen zu können.

DOI
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