Struktur-Funktionsanalyse von AtTPC1, einem Zwei-Poren Kationenkanal aus Arabidopsis thaliana

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2016-11-23
Issue Year
2016
Authors
Schulze, Christina
Editor
Abstract

In 1986 the Slow Vakuolar (SV) Channel was first described as an ion channel of the Tonoplast and electrophysiological characterized. In the year 2005 AtTPC1 was identified as the protein, generating the SV current in the model plant Arabidopsis thaliana. Because the SV-channel had been extensively electrophysiologically analyzed in the intervening 20 years, the main task of this thesis was to identify structures in the protein, regulating already know electrophysiological functions of the channel. Therefore potentially regulatory structures, either domains or single amino acids were mutated in-vitro and the resulting altered TPC1-protein was examined for corresponding-ly changed biophysical properties. In order to electrophysiologically analyze the mutated ion channels without the time intensive work of indentifying stable plant lines, a system was established, to biophysically characterize the TPC1-constructs in transient trans-formed protoplasts. The mutated ion channels were c-terminally fused with GFP and tran-siently transformed in mesophyll protoplast of the TPC1-loss-of-function-line, tpc1-2. Afterwards the fluorescent vacuoles of the transformed protoplasts were elect¬ro¬phy¬sio¬lo-gi¬cally analyzed. On comparison neither the voltage dependence, nor the open probability or the calcium dependence of AtTPC1-GFP in tpc1-2 showed any difference to the TPC1 of the wildtype Col0 plants. To provide a better understanding of the targeting mechanism of TPC1 several deletion mutants were generated and their localization examined. During this experiment it became apparent, that the deletion of transmembrane helices lead to a accumulation of the deletion-proteins in the ER presumably due to a disruption of the channel’s assembly. Additionally it could be shown that the C-terminus of TPC1 has no influence on the tar-geting of the channel but is essential for its biophysical function. On the other side the N-terminus is essential for the correct trafficking and targeting of TPC1. The deletion of the in plant TPCs conserved KAAL-domain located in the N-terminus lead to a loss of activi-ty in the ion channel. Altogether the results show that a deletion of transmembrane re-gions or the N-terminus influences the targeting, whereas deletions in the C-terminus are nonconsequential for the targeting and trafficking. Additionally the mechanism of the calcium dependant activation in TPC1 could be solved. To this goal both EF-hands in TPC1 were silenced with point mutations. The Patch-Clamp Analysis of the TPC1-mutants TPC1-D335A, TPC1-D376A and TPC1-D335/376A allowed the conclusion that EF-Hand 2 is the main ligand binding site, as a mutation of both EF-hands or only EF-hand 2 results in complete inactivity of the chan-nel. Whereas EF-hand 1 modulates the calcium dependency of the channel, as the de-struction of the binding ability of EF-hand 1 does not abolish the channel activity but influences the cooperativity of the Calcium binding and shifts the Calcium sensitivity to higher conzentrations. The Mutation T378D lead to a higher calcium affinity, whereas the mutation T378A leads to reduced calcium sensitivity. This hints to a potential regulation of the calcium affinity by phosphorylation at T378. These effects could be corroborated by modeling the EF-hands in 3D. According to the model EF-Hand 1 has a reduced ligand number which makes a steric function in the appostate or the binding of a Magnesium ion likely. EF-Hand 2 as enough ligands in the model to facilitated the complexation of a Calcium ion. The Binding could even be im-proved by bridging a 3.8 Å distance to T378, by phosphorylation of this amino acid. This improvement could be successfully demonstrated in TPC1-T378D. The kinase CIPK1 of the CBL/CIPK network was identified as a potential interaction partner. A comparison of the TPC1 activity in the CIPK1 loss-of-function lines cipk1-1 und cipk1-2 with the channel activity in Col0 showed no difference in activity, voltage dependence, calcium sensitivity, or deactivation kinetic. None the less the interaction of TPC1 on CIPK1 could be confirmed in a BiFC co-transformation of Arabidopsis meso-phyll protoplasts. But the addition of CIPK1 together with CBL2 and 3 as a recombinant protein solution did not alter the activity of TPC1 in a biophysical analysis. Thus the regulatory consequences of the interaction between TPC1 and CIPK1 could not be identi-fied under the tested conditions. The in other works published reduction of TPC1 activity by the 14-3-3 protein GRF6 could not be reproduced under the conditions tested in this publication.

Abstract

Der Slow Vakuolar (SV) Kanal wurde 1986 zum ersten Mal als Ionenkanal in der Vakuo-le elektrophysiologisch charakterisiert. 2005 wurde AtTPC1 als das Protein identifiziert, welches den SV-Strom in Arabidopsis thaliana generiert. In den dazwischenliegenden 20 Jahren wurde der SV-Kanal und somit TPC1 extensiv elektrophysiologisch untersucht. Deshalb war die Aufgabe dieser Arbeit, Strukturen im Protein zu identifizieren, die be-reits bekannte elektrophysiologische Funktionen im Kanal steuern. Hierzu wurden potentiell regulatorische Strukturen, Domänen oder einzelne Aminosäuren, in-vitro mutiert und das veränderte TPC1-Protein elektrophysiologisch auf eine kor-respondierende Veränderung hin untersucht. Um diese Analyse ohne die zeitaufwändige Generierung stabiler Pflanzenlinien druchführen zu können, wurde ein System zur elekt-rophysiologischen Charakterisierung der mutierten Kanäle in transient transformierten Protoplasten ausgearbeitet. Die TPC1-Variationen wurden C-Terminal mit GFP fusioniert und transient in Mesohyllprotoplasten der TPC1-Verlustlinie tpc1-2 transformiert. Die fluoreszierenden Vakuolen der transformierten Protoplasten wurden elektrophysiologisch untersucht. In einem Vergleich der TPC1 Aktivität im Col0 Wildtyp und der Aktivität von TPC1-GFP in tpc1-2 konnte kein Unterschied in der Spannungsabhängigkeit und Kinetik festgestellt werden. Um die Mechanismen des Traffickings und Targetings von TPC1 besser zu verstehen, wurden Deletionsmutanten hergestellt und deren Lokalisation analysiert. Paarweise Dele-tion von Transmembranhelices führte zu einer Akkumulation der Deletionsproteine im ER, vermutlich auf Grund einer Störung des Assemblys des Kanals. Der C-Terminus von TPC1 hat keine Bedeutung für das vakuoläre Targeting, ist jedoch unabdingbar für die Funktionalität des Ionenkanals. Der N-Terminus hingegen ist notwendig für das korrekte Trafficking und Targeting von TPC1. Die Deletion einer in pflanzlichen TPCs konser-vierten KAAAL-Domäne im N-Terminus führte zu einem Aktivitätsverlust des Kanals. Diese Ergebnisse zeigen die herausragende Bedeutung des N-Terminus für das korrekte Targeting von TCP1. Zudem wurde der Mechanismus der Ca2+-abhängigen Aktivierung von TPC1 aufgeklärt. Dazu wurden die beiden EF-Hände in TPC1 durch Punktmutationen stillgelegt. Aus der Patch-Clamp Analyse der TPC1-Punktmutationen TPC1-D335A, TPC1-S376A sowie TPC1-D335/376A konnte gefolgert werden, dass die EF-Hand 2 die Hauptligandenbin-destelle ist, da eine Mutation in EF2 zu einer völligen Stilllegung des Kanals führte. EF-Hand 1 hingegen moduliert nur die Calciumabhängigkeit, indem sie die Kooperativität der Calciumbindung beeinflusste und die Calciumsensitivität zu höheren Konzentrationen verschob. Die Mutation T378D führte zu einer Erhöhung der Calciumaffinität, wohinge-gen die Mutation T378A die Calciumsensitivität verringerte. Dies deutet auf eine potenti-elle Regulation der Calcium¬affinität durch eine Phosphorylierung an T378 hin. Diese Effekte ließen sich durch eine Modellierung der EF-Hände erklären, wonach in EF-Hand 1 die Liganden reduziert sind, was eine sterische Funktion im Apozustand oder die Bindung eines Magnesiumions wahrscheinlich erscheinen ließ. EF-Hand 2 hat in dem Modell ausreichend Liganden für die Komplexierung eines Calciumions zu Verfügung und könnte diese sogar durch die Überbrückung eines 3.8 Å Abstands bei T378, durch Phosphorylierung noch erhöhen. Diese Erhöhung konnte in TPC1-T378D erfolgreich simuliert werden. Als potentieller Interaktionspartner des Kanals wurde CIPK1, eine Kinase des CBL/CIPK Netzwerkes, untersucht. In einer BiFC Analyse, durch transiente Kotransformation in Mesophyllprotoplasten von Arabidopsis, konnte die Interaktion von TPC1 mit CIPK1 gezeigt werden. Beim Vergleich der TPC1 Aktivität in den CIPK1-Verlustlinien cipk1-1 und cipk1-2 mit der Kanalaktivität in Col0 konnte kein Unterschied in der Aktivität, Spannungsabhängigkeit, Calciumsensitivität oder Kinetik gemessen werden. Bei der Zugabe von CIPK1 in Verbindung mit CBL2 und 3 in einer rekombinanten Proteinlösung, zu aktivem TPC1 konnte keine Veränderung der Aktivität des Kanals gemessen werden. Die regulatorische Konsequenz für den Kanal aus der Interaktion mit der Kinase konnte unter den gemessenen Bedingungen nicht identifiziert werden. Die in anderen Arbeiten beschriebene Negativregulierung der TPC1 Aktivität durch das 14-3-3 Protein GRF6 konnte unter der in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen nicht nachgewiesen werden.

DOI
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