Novel insights into the aberrant activation of fibroblasts in systemic sclerosis - Casein kinase 2, Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1, and Janus kinase1 mediated transactivation of Janus kinase2 as novel players

Neue Einsichten in die anomale Aktivierung von Fibroblasten in der Systemischen Sklerose – Casein Kinase 2-, Poly(ADP-ribose)-Polymerase 1- und Janus Kinase 1-vermittelte Transaktivierung von Janus Kinase 2 als neue Mechanismen

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus4-76167
  • A major hallmark of Systemic Sclerosis (SSc) is the uncontrolled and persistent activation of fibroblasts, which release excessive amounts of extracellular matrix. The accumulation of extracellular matrix proteins disrupts the tissue architecture leading to organ dysfunction and causing high morbidity and mortality in patients. Transforming growth factor-β (TGFβ) has been characterized as a key-mediator of fibroblast activation in SSc and other fibrotic diseases. Numerous studies demonstrate increased TGFβ signaling in SSc and in other fibrotic diseases and highlight that persistent activation of TGFβ is sufficient to induce fibrosis. However, the precise molecular mechanisms and theA major hallmark of Systemic Sclerosis (SSc) is the uncontrolled and persistent activation of fibroblasts, which release excessive amounts of extracellular matrix. The accumulation of extracellular matrix proteins disrupts the tissue architecture leading to organ dysfunction and causing high morbidity and mortality in patients. Transforming growth factor-β (TGFβ) has been characterized as a key-mediator of fibroblast activation in SSc and other fibrotic diseases. Numerous studies demonstrate increased TGFβ signaling in SSc and in other fibrotic diseases and highlight that persistent activation of TGFβ is sufficient to induce fibrosis. However, the precise molecular mechanisms and the intracellular signaling cascades that mediate the TGFβ-induced activation of fibroblasts are still incompletely understood. The purpose of the first part of the study was to characterize whether Casein kinase II (CK2) contributes to the pathologic activation of fibroblasts in patients with SSc and to evaluate the anti-fibrotic potential of CK2 inhibition. We found that expression of CK2 was increased in skin fibroblasts of SSc patients. Inhibition of CK2 by selective CK2 inhibitor 4, 5, 6, 7-Tetrabromobenzotriazole (TBB) abrogated the TGFβ induced activation of JAK2/STAT3 signaling and prevented the stimulatory effects of TGFβ on collagen release and myofibroblasts differentiation in cultured fibroblasts. Treatment with TBB also ameliorated bleomycin-induced dermal fibrosis as well as skin fibrosis induced by adenoviral overexpression of a constitutively active TGFβ receptor I (AdTBR). The anti-fibrotic effects of TBB in both mouse models were accompanied by reduced activation of Janus kinase 2 (JAK2) / signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling. In the second part of the study, the role of the enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) in the pathogenesis of SSc was investigated. Decreased expression of PARP-1 was detected in skin sections of SSc patients, particularly in fibroblasts. Upon stimulation of fibroblasts with TGFβ, PARP-1 binds to Smad3, which inhibited Smad-dependent gene expression via poly(ADP-ribosyl)ation (PARylation). Inactivation of PARP-1 promoted accumulation of phosphorylated Smad3, enhanced Smad-dependent transcription and upregulated the expression of TGFβ/Smad target genes. Treatment with 3-Aminobenzamide (3AB) enhanced the effect of TGFβ on collagen release and myofibroblast differentiation in vitro. Inhibition of PARP-1 also exacerbated experimental fibrosis in vivo. PARP-1 deficiency induced a more severe fibrotic response to bleomycin with increased dermal thickening, hydroxyproline contents and myofibroblast counts. Additionally, inhibition of PARylation strongly exacerbated fibrosis in Tsk-1 mice. We demonstrate that PARP-1 negatively regulates canonical TGFβ signaling in experimental skin fibrosis. The downregulation of PARP-1 in SSc fibroblasts may thus directly contribute to hyperactive TGFβ signaling and to persistent fibroblast activation in SSc. The third part of the study evaluates strategies to overcome transactivation of Janus kinase 2 (JAK2) by JAK1 induced by long-term inhibition of JAK2. We observed that the inhibitory effect of the selective inhibitor TG101209 on JAK2 decreased upon long-time incubation, resulting in ineffective inhibition of TGFβ-induced fibroblast activation and collagen release. In bleomycin-induced pulmonary fibrosis and AdTBR-induced skin fibrosis, combined inhibition of JAK2 and heat-shock protein 90 (HSP90) by cotreatment with TG101209 and 17-DMAG had more potent anti-fibrotic effects as compared to monotherapy with either of the two compounds. Moreover, combined inhibition of JAK1 and JAK2 by Ruxolitinib showed also more pronounced anti-fibrotic effects than the selective JAK2 inhibitor TG101209. The results of the thesis might have clinical implications. Small molecules to target CK2, JAKs or HSP90 are either in advanced clinical development or already approved for clinical use. Targeting of CK2 and JAK2 may thus be novel therapeutic approaches for SSc and other fibrotic diseases. My thesis also identifies PARP-1 as a central regulator of skin fibrosis by interacting with TGFβ signaling, and implicates that therapies re-activating PARP-1 may be of interest for clinical evaluation.show moreshow less
  • Eines der wichtigsten Kennzeichen von Systemischer Sklerose (SSc) ist die unkontrollierte und anhaltende Aktivierung von Fibroblasten, welche zur übermäßigen Freisetzung von extrazellulärer Matrix führt. Die Akkumulation extrazellulärer Matrixproteine zerstört die Gewebearchitektur, was in der Folge zur Fehlfunktion der betroffenen Organe und zu starkem Leidensdruck und einer hohen Sterblichkeitsrate der Patienten führt. Transforming growth factor-β (TGFβ) wurde als Schlüsselfaktor bei der Aktivierung von Fibroblasten in SSc und anderen fibrotischen Erkrankungen identifiziert. Zahlreiche Studien haben eine verstärkte Aktivierung der TGFβ-Signalkaskade in SSc und anderen fibrotischenEines der wichtigsten Kennzeichen von Systemischer Sklerose (SSc) ist die unkontrollierte und anhaltende Aktivierung von Fibroblasten, welche zur übermäßigen Freisetzung von extrazellulärer Matrix führt. Die Akkumulation extrazellulärer Matrixproteine zerstört die Gewebearchitektur, was in der Folge zur Fehlfunktion der betroffenen Organe und zu starkem Leidensdruck und einer hohen Sterblichkeitsrate der Patienten führt. Transforming growth factor-β (TGFβ) wurde als Schlüsselfaktor bei der Aktivierung von Fibroblasten in SSc und anderen fibrotischen Erkrankungen identifiziert. Zahlreiche Studien haben eine verstärkte Aktivierung der TGFβ-Signalkaskade in SSc und anderen fibrotischen Erkrankungen gezeigt und konnten nachweisen, dass konstante Aktivierung des TGFβ-Signalweges ausreichend ist, um Fibrose zu induzieren. Die genauen molekularen Mechanismen und die intrazellulären Signalkaskaden, welche zu der TGFβ induzierten Aktivierung von Fibroblasten führen, sind jedoch noch immer unvollständig verstanden. Im ersten Teil dieser Studie sollte der Einfluss von Casein Kinase II (CK2) auf die pathologische Aktivierung von Fibroblasten in SSc-Patienten und das antifibrotische Potential von CK2 Inhibitoren evaluiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von CK2 in Hautfibroblasten von SSc-Patienten erhöht war. Inhibition von CK2 durch den selektiven CK2-Inhibitor 4, 5, 6, 7-Tetrabromobenzotriazole (TBB) setzte die TGFβ induzierte Aktivierung der JAK2/STAT3-Signalkaskade außer Kraft und verhinderte sowohl die TGFβ induzierte Freisetzung von Kollagen als auch die Differenzierung von Myofibroblasten in kultivierten Fibroblasten. Eine Behandlung mit TBB führte darüber hinaus zu einer Verbesserung der Fibrose sowohl im Modell der Bleomycin-induzierten dermalen Fibrose als auch bei Hautfibrose, die durch adenovirale Überexpression eines konstitutiv aktiven TGFβ Rezeptor I (AdTBR) induziert wurde. Die antifibrotischen Eigenschaften von TBB in beiden Mausmodellen gingen mit einer reduzierten Aktivierung des JAK2 (Janus kinase 2) / STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)-Signalweges einher. Im zweiten Teil der Studie wurde die Rolle des Enzyms Poly(ADP-ribose) Polymerase-1 (PARP-1) in der Pathogenese der SSc untersucht. Es wurde eine verminderte Expression von PARP-1 in Hautproben von SSc-Patienten, insbesondere in Fibroblasten, gefunden. Wenn Fibroblasten mit TGFβ stimuliert wurden, konnte eine Bindung von PARP-1 an Smad3 nachgewiesen werden, wodurch die Smad-abhängige Genexpression mittels Poly(ADP-ribosyl)ierung (PARylierung) inhibiert wurde. Inaktivierung von PARP-1 führte zu einer Ansammlung von phosphoryliertem Smad3, verstärkter Smad-abhängiger Transkription und erhöhter Expression von TGFβ-/Smad-Zielgenen. Behandlung mit 3-Aminobenzamid (3AB) verstärkte den Einfluss von TGFβ auf die Kollagenfreisetzung und Myofibroblasten-Differenzierung in vitro. Darüber hinaus verstärkte die Inhibition von PARP-1 experimentelle Fibrose in vivo. Defizienz für PARP-1 resultierte in schwerwiegenderen fibrotischen Effekten durch Bleomycin, mit stärkerer dermaler Verdickung, einem erhöhten Hydroxyprolingehalt und einer gesteigerten Anzahl von Myofibroblasten. Ebenso verschlimmerte die Inhibition von PARylierung Fibrose in Tsk-1 Mäusen deutlich. Wir demonstrieren, dass PARP-1 den kanonischen TGFβ-Signalweg in experimenteller dermaler Fibrose negativ reguliert. Die Herabregulierung von PARP-1 in SSc Fibroblasten könnte also direkt zur Hyperaktivierung der TGFβ-Signalkaskade und zur anhaltenden Aktivierung von Fibroblasten in SSc beitragen. Im dritten Teil der Studie werden Strategien zur Umgehung einer Transaktivierung der Janus Kinase 2 (JAK2) durch JAK1, welche durch Langzeitinhibtion von JAK2 hervorgerufen wird. Wir konnten beobachten, dass der inhibierende Effekt des selektiven Inhibitors TG101209 auf JAK2 bei länger andauernder Inkubation abnimmt. Dies führt zu einer ineffektiven Inhibierung der TGFβ-induzierten Aktivierung von Fibroblasten und Kollagenfreisetzung. In den Modellen der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose und der AdTBR-induzierten dermalen Fibrose zeigt eine kombinierte Blockade von JAK2 und Heat-Shock Protein 90 (HSP90) durch simultane Behandlung mit TG101209 und 17-DMAG eine stärkere antifibrotische Wirkung als eine Behandlung mit nur jeweils einem der Inhibitoren. Darüber hinaus war der antifibrotische Effekt einer kombinierten Inhibition von JAK1 und JAK2 durch Ruxolitinib deutlicher als bei dem JAK2-selektiven Inhibitor TG101209. Die Ergebnisse dieser Dissertation könnten klinische Konsequenzen haben. Substanzen, welche zielgerichtet CK2, JAKs oder HSP90 modifizieren sind entweder bereits in fortgeschrittener klinischer Entwicklung oder bereits für die klinische Nutzung zugelassen. Das Blockade von CK2 und JAK2 könnte also ein neuer therapeutischer Ansatz für die Behandlung von SSc und anderen fibrotischen Erkrankungen sein. Meine Dissertation identifiziert des weiteren PARP-1 als einen zentralen Regulator von dermaler Fibrose, welcher mit dem TGFβ-Signalweg interagiert. Dies impliziert, dass PARP-1 reaktivierende Therapien für eine klinische Evaluation von Interesse sein könnten.show moreshow less

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Metadaten
Author:Yun Zhang
Persistent identifiers - URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus4-76167
Referee:Andreas Gießl
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of publication:2016
Date of online publication (Embargo Date):2016/09/14
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Acceptance date of the thesis:2016/09/06
Release Date:2016/09/21
SWD-Keyword:SSc
Length/size:1-120
Institutes:Naturwissenschaftliche Fakultät
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
open_access (DINI-Set):open_access
Licence (German):Creative Commons - CC BY - Namensnennung 3.0