HIV spezifische Immunität und virale Fluchtmechanismen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2008-10-15
Issue Year
2008
Authors
Maurer Katja, 
Editor
Abstract

7 Summary Several factors can influence the susceptibility and resistance to the HIV-1 infection, as well as the course of the infection. To analyse different aspects of the HIV pathogenesis HIV genes, genetic factors and immunological parameters were analysed in selected patient groups. The analysis of infected couples has the advantage that the source of infection is known and the analysis of the partners viruses provides important information about the infecting viral strain. 7.1 Analyses of CTL escape mutations in HLA-B8-positive patients A focus was the thorough analysis of a female patient, who was an excellent controller of HIV-1 viremia since 1998. An association of developing CTL escape mutations in Nef with the loss of viral control could be demonstrated. The longitudinal analysis of that female demonstrated the emergence of CTL escape mutations within the two B8-restricted epitopes FLKEKGGL (FL8) and WPAIRERM (WM8). Detailed analysis of recognition of variants revealed a reduction of the recognition of the variants in WM8 and FL8. To investigate the role of mutations within the immunodominant FL8 epitope we analysed Nef sequences in a cohort of 23 HLA-B8-positive and 33 B8-negative HIV-1-infected patients. A significant correlation between the occurrence of mutations in the FL8 epitope and the presence of the HLA-B8-allele could be observed. ELISPOT analysis revealed that mutations within the FL8 epitope could decrease CTL recognition in the B8-positve patients. Strong differences regarding the recognition of viral variants between individual CTL lines from different donors could be observed. The data demonstrate a strong CTL selection pressure on the immunodominant HLA-B8-restricted CTL epitope FL8 in HIV-1 Nef. The association of FL8 mutations with lower CD4 counts indicate an important role of CTL escape mutations for disease progression. 7.2 Analyses of genetic, immunological and virological factors in a patient couple with divergent course of the HIV-1 infection despite infection with the same virus In another investigated heterosexual couple the female patient U was infected by her male partner, patient R. While the male had progressed to AIDS the female showed an excellent HIV-1 control. A variety of mutations in the viral genes of the female’s HI-Viruses, especially in nef, could be detected. Hints for functionally active genetic polymorphisms in Apobec3G or an activity of other hypermutating genes could not be found. A normal CCR5 expression on cells of both patients could be demonstrated and PCR-analyses could rule out the 32-bp deletion in the CCR5 gene leading to a reduced CCR5 expression. The performed infection assays in cooperation with PD Dr. Karin Metzner revealed that the CD4+ T-cells of patient U could be infected with different tropic HIV-1 lab strains, that the cell supernatant of PHA stimulated PBMC of that patient did not show any influence on the replication of different HIV-1 lab strains and that the sera of that patient showed a dose dependent inhibition of the infection with different tropic HIV-1 lab strains. The further analyses of the neutralizing capacity of the serum of patient U in cooperation with Sascha Antoni (Institute of Biomedical Research, Frankfurt) strongly indicates that other factors in addition to neutralizing antibodies were responsible for the excellent control of viremia. ELISPOT analyses demonstrated strong and broad CTL responses for patient U. The nef genes of the female’s viruses were strongly mutated and an unusual five amino acid deletion within the C-terminal region could be detected. The direct PCR-based sequencing as well as sequence analyses of cloned nef genes of the HI-viruses of the patient U did not show any viruses lacking the five amino acid deletion. By contrast this five amino acid deletion could not be found in the nef genes of her partner’s viruses. To analyse whether these mutations and the deletion in Nef were induced by CTL, the immune response of patient U was examined both by using overlapping Nef peptides and electroporated autologous Nef mRNA. A Nef-specific strong immune response by detecting at least responses against four epitopes, could be demonstrated. The detection that CTLs of patient U recognize an epitope comprising the five deleted amino acids strongly indicates that the deletion was selected by the CTLs of the female. To clarify whether this deletion and the other mutations contribute to a potential attenuation of the patient viruses we performed functional analyses in cooperation with Frank Kirchhoff that showed a reduced up-regulation of the invariant chain by Nef. As the Nef-induced up-regulation of the invariant chain seems to be an important escape mechanism leading to an inhibition of the antigen presentation in the HLA-class-II-pathway, it is possible that this reduced Nef-function contributes to the good HIV control in patient U. In summary the data strongly suggest that the reasons for the excellent control of viremia in patient U are due to a broad and strong CTL response, but also due to the presence of neutralizing antibodies. Additionally, the analyses of Nef mutations and the five amino acid deletion in Nef strongly indicate that they were developed in patient U due to a selection pressure by her CTLs. These mutations and the deletion lead to a reduced up-regulation of the invariant chain of the MHC-class-II-pathway by Nef and thus led to a potentially preserved CD4+ T-cell response. 7.3 Treatment with steroids led to a loss of the so far good control of HIV-1 viremia in Patient M Additional sequence analyses were performed in a patient who showed a good control of HIV-1. When the patient was treated with steroids for an orthopaedic problem, he developed a strong increase of viremia and drop of CD4-cells. A decline of CTL activity against his dominant CTL epitopes in Nef, Gag and in Pol could be observed. Sequence analyses of the gag, pol and nef genes of different time points revealed no emergence of new escape mutations in the gag and the pol gene three to six months after steroid application. In Nef an L-to-M mutation at position 7 could be found in his dominant HLA-B13-restricted epitope RQDILDLWV. ELISPOT analysis revealed a strong reduction of the recognition of the mutated peptide. Altogether, these data suggest that the application of steroids led to a functional inhibition of his T-cell response allowing an enhanced viral replication that ultimately led to the development of CTL escape mutations especially in his dominant CTL epitope. 7.4 Preservation of normal CD4 counts despite high viral load in Patient F The investigation of HIV-1 sequences in a patient with good CD4 counts despite a high viral load, revealed two mutations within the PAK-binding site in Nef. These mutations are presumably CTL escape mutations within the HLA-B27–restricted CTL epitope RRQDILDLWI. Both mutations are unusual and the R-to-E mutation at position P1 is located within the “RR” motif of the PAK-binding site. Mutation within this motif could knock off several Nef functions. To clarify whether these mutations contribute to a postulated attenuation of the patient viruses as he preserved a normal CD4 count despite a high viral load, nef genes of this patient were amplified and cloned into expression vectors for the use in functional assays that were performed in cooperation with Frank Kirchhoff (Virology, Ulm). The results out of these functional analyses revealed a higher level of T- cell receptor (TCR)-CD3 down-modulation and a lower percentage of activation-induced cell death (AICD) by the nef gene of that patient compared to two different wild type nef genes expressing controls. This is in line with published data by Schindler et al, 2006, who reported that nef alleles from the majority of primate lentiviruses, including HIV-2, down-modulate TCR-CD3 from infected T-cells, thereby blocking the responsiveness to AICD. 7.5 Analysis of the lytic ability of TCR-RNA electroporated T-cells and the influence on the infection with lab strain NL4-3 These investigations were performed in cooperation with Jan Dörrie and Niels Schaft (Department of Dermatologie, Erlangen). The investigation should help to clarify whether virus-specific T-cells, generated by electroporation of a virale-specific TCR mRNA, are functional. The chromium-release-assay conducted with peptide loaded target cells, showed a lytic ability of the reprogrammed CD8+ T-cells which was comparable to those observed for peptide stimulated CTL lines. Neither the reprogrammed T-cells nor the peptide stimulated CTL lines showed an influence on the replication of lab strain NL4-3 in cocultures.

Abstract

6 Zusammenfassung Verschiedene Faktoren können die Suzeptibilität und Resistenz gegen die HIV-1 Infektion, aber auch die Geschwindigkeit der Krankheitsprogression beeinflussen. Um verschiedene Aspekte für die HIV Pathogenese zu untersuchen, wurden die HIV Gene, sowie genetische und immunologische Faktoren, in ausgewählten Patientengruppen untersucht. Die Analyse von infizierten Paaren bietet hierbei den Vorteil, dass die Infektionsquelle bekannt ist und wichtige Informationen über den viralen Stamm liefert. 6.1 Analyse von CTL FLuchtmutationen in HLA-B8-positiven Patienten Ein Schwerpunkt war die sorgfältige Analyse der Patientin 01, die seit 1998 eine gute Kontrolle der HIV Infektion aufrechterhalten konnte. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Entwicklung von CTL Fluchtmutationen in Nef mit dem Verlust der Kontrolle über die HI-Viren gezeigt werden. Die Langzeitanalyse der Patientin demonstrierte das Auftreten von CTL Fluchtmutanten in den beiden B8-restringierten Epitopen FLKEKGGL (FL8) und WPAIRERM (WM8). Die detaillierte Analyse der Variantenerkennung zeigte eine abgeschwächte Erkennung für die beobachteten WM8 und FL8 Varianten. Um die Bedeutung von Mutationen innerhalb des immunologisch dominanten FL8-Epitopes zu untersuchen, wurden die Nef-Sequenzen in einer Kohorte von 23 HLA-B8-positiven und 33 B8-negativen HIV-1 infizierten Patienten analysiert. Eine signifikante Korrelation konnte für das Auftreten von Mutationen in dem FL8-Epitop und HLA-B8 beobachtet werden. Die ELISPOT-Analysen ergaben, dass Mutationen innerhalb des FL8-Epitopes die CTL Erkennung in den B8-positiven Patienten beeinträchtigten. Zudem konnten innerhalb der Patientenkohorte erhebliche Unterschiede bezüglich der Erkennung von den verschiedenen Varianten beobachtet werden. Die Daten zeigen einen starken CTL-Selektionsdruck auf das immunologisch dominante, HLA-B8-restringierte CTL Epitop FL8 in Nef. Die Assoziation von FL8 Mutationen mit einer niedrigeren CD4 Zellzahl, weist auf eine wichtige Rolle von CTL Fluchtmutanten innerhalb von FL8 für die Krankheitsprogression hin. 6.2 Analyse von genetischen, immunologischen und virologischen Faktoren bei einem Patientenpaar mit divergentem Krankheitsverlauf trotz Infektion durch das gleiche Virus Bei dem heterosexuellen Paar wurde die Patientin U von ihrem Partner, Patient R infiziert. Während der Patient R in einem Zeitraum von 12 Jahren eine Progression in das Stadium AIDS zeigte, ist es der Patientin U möglich, die Infektion außergewöhnlich gut zu kontrollieren. Es konnten eine Vielzahl von Mutationen in den viralen Genen der Patientin U vor allem in Nef gefunden werden. Hinweise für einen funktionell aktiven genetischen Polymorphismus in Apobec3G bzw. für eine Aktivität anderer hypermutierender Gene konnten nicht gefunden werden. Es zeigte sich eine normale CCR5 Expresssion auf Zellen beider Patienten und PCR-Analysen konnten die d32-Basenpaardeletion von CCR5 ausschließen, welche zu einer verringerten Expression von CCR5 führt. Die durchgeführten Infektionsanalysen in Kooperation mit PD Dr. Karin Metzner ergaben, dass die CD4+ T-Zellen der Patientin U mit verschiedenen HIV-1 Laborstämmen mit unterschiedlichen Chemokinrezeptortropismen infiziert werden konnten, dass Zellkulturüberstand von PHA-stimulierten PBMC der Patientin keinen Einfluss auf die Replikation von verschiedenen HIV-1 Laborstämmen zeigte und, dass das Serum der Patientin eine dosisabhängige Hemmung auf die Infektion mit verschieden tropen HIV-1 Laborstämmen hatte. Die vertieften Analysen zu der neutralisierenden Aktivität des Serums der Patientin in Kooperation mit Sascha Antoni (Biomedizinisches Forschungszentrum, Frankfurt) wiesen stark darauf hin, dass die extrem gute Kontrolle der HIV-1 Infektion bei dieser Patientin, nicht alleine auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern zurückgeführt werden konnte. In den ELISPOT-Analysen konnte zudem eine starke und breite CTL Antwort für die Patientin U detektiert werden. Die nef Gene der HI-Viren der Patientin U waren stark mutiert und wiesen eine ungewöhnliche fünf Aminosäure langen Deletion innerhalb der C-terminalen Region auf. Sowohl mittels direkter PCR-basierter Sequenzierung als auch mittels Sequenzanalysen von klonierten nef Genen der HI-Viren der Patientin konnten keine Viren in der Patientin entdeckt werden, welche die fünf-Aminosäuren-Deletion nicht enthielten. Bei ihrem Partner fanden sich dagegen keine Nef Gene mit Deletionen. Um zu prüfen, ob die Mutationen und die Deletion in Nef durch CTL induziert wurden, wurde die Immunantwort der Patientin unter Verwendung von überlappenden Nef Peptiden und mit Hilfe transfizierter autologer Nef RNA untersucht. Es konnte eine starke Nef-spezifische Immunantwort mit Erkennung von mindestens vier Epitopen gezeigt werden. Der Nachweis von CTL in der Patientin, welche ein Epitop erkannten, das die fünf Aminosäuren aus der Deletion enthielt, ist ein starker Beleg dafür, dass die Deletion durch CTL der Patientin selektioniert wurden. Die Funktionsanalysen zur Klärung ob diese Deletion zu einer potenziellen Abschwächung der HI-Viren in der Patientin U beitrugen, wurden in Kooperation mit Prof. Frank Kirchhoff (Virologie, Ulm) durchgeführt und zeigten insbesondere eine geringere Heraufregulierung der Invarianten Kette durch Nef. Da die Nef-bedingte Hochregulierung der Invarianten Kette über die damit verbundene Hemmung der Antigenpräsentation im HLA-Klasse-II-Weg einen wichtigen Fluchtmechanismus darstellt könnte vermutet werden, dass eine Abschwächung dieser Nef-Funktion an dem guten Verlauf der Patientin beteiligt ist. Insgesamt lassen die Daten darauf schließen, dass die Ursachen für den extrem guten HIV Infektionsverlauf in der Patientin U sehr wahrscheinlich auf ihre breite und starke CTL Antwort, aber auch auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern zurückgeführt werden kann. Zudem weisen die Analysen der Nef-Mutationen und der fünf Aminosäuren langen Deletion in Nef stark darauf hin, dass diese durch einen Selektionsdruck, ausgeübt durch spezifische CTLs der Patientin U entstanden sind. Diese Mutationen und die Deletion führten zu einer verminderten Heraufregulierung der Invarianten Kette des MHC-Klasse-II-Weges durch Nef, was dann zu einer potentiell verstärkten CD4+ T-Zellantwort geführt haben könnte. 6.3 Verlust einer bisher guten Kontrolle der HIV Infektion durch eine immunsuppressive Therapie mit Steroiden bei Patient M: Weiterhin wurden virale Sequenzanalysen bei einem Patienten durchgeführt, der bisher eine gute Kontrolle der HIV-1 Infektion zeigte. Nach der Behandlung mit Steroiden aufgrund einer orthopädischen Erkrankung kam es bei diesem zu einem starken Anstieg der Viruslast und einem Absinken der CD4+ T-Zellen. Es konnte eine Abnahme der CTL Aktivität gegen seine dominanten Epitope in Nef, Gag und Pol beobachtet werden. Die Sequenzanalyse der gag, pol und nef Gene von verschiedenen Zeitpunkten ergaben drei bis sechs Monate nach der Behandlung mit Steroiden, keine neu entstandenen Mutationen in den gag und pol Genen. Im Nef Protein konnte eine L-zu-M Mutation an Position 7 in seinem dominanten, auf HLA-B13-restringierten Epitop RQDILDLWV, gefunden werden. Die ELISPOT-Analysen zeigten eine stark reduzierte Erkennung des mutierten Peptides. Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass die Behandlung mit Steroiden zu einer funktionellen Hemmung seiner T-Zellantwort geführt hatte. Die Konsequenz daraus war dann eine verstärkte Virusreplikation, welche zu einem erhöhten Risiko für die Bildung von Fluchtmutationen vor allem in den dominanten Epitopen führte. 6.4 Bewahrung einer normalen Anzahl von CD4+ T-Zellen trotz hoher Viruslast bei Patient F: Die Untersuchungen zu dem Patienten F, welcher trotz hoher Viruslast eine im Normbereich liegende CD4 Zellzahl aufwies, zeigten zwei Mutationen in der funktionell wichtigen Bindungsregion für PAK in Nef. Diese Mutationen sind sehr wahrscheinlich CTL FLuchtmutationen in dem auf HLA-B27-restringierten Epitop RRQDILDLWI. Beide Mutationen sind ungewöhnlich und die R-zu-E Mutation an Position 1 ist in dem sogenannten “RR” Motiv innerhalb der PAK-Bindungsstelle lokalisiert. Mutationen innerhalb diesen Motives können verschiedene Nef Funktionen ausschalten. Um zu Klären ob diese Mutationen zu einer postulierten Abschwächung der HI-Viren in dem Patienten beitrugen, nachdem dieser eine normale CD4+ T-Zellantwort trotz der hohen Viruslast aufwies, wurden für funktionelle Analysen, die nef Gene seiner HI-Viren amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert. Diese Analysen wurden in Kooperation mit Prof. Frank Kirchhoff (Virologie, Ulm) durchgeführt. Die Ergebnisse aus diesen funktionellen Analysen ergaben eine stärkere Herabregulierung des TCR-CD3 und weniger apoptotische Zellen im Vergleich zu zwei, dem Wildtyp entsprechenden Kontroll-Nefgenen. Diese Daten stehen in Einklang mit den publizierten Daten von Schindler et al, 2006, welche zeigen, dass die Nef Allele der meisten Primaten-Lentiviren, inklusive HIV-2, die Expression des TCR-CD3 in infizierten Zellen herunterregulieren. Die Zellen werden dadurch weniger dem durch Aktivierung induzierten Zelltod ausgesetzt (AICD). 6.5 Untersuchung der HIV spezifischen Lyse durch TCR-RNA elektroporierte T-Zellen und deren Einfluss auf die Infektion mit dem Laborstamm NL4-3 Diese Untersuchungen erfolgten in Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Jan Dörrie und Niels Schaft (Dermatologie, Erlangen) und sollten zur Klärung der Funktionsfähigkeit von virusspezifischen T-Zellen, welche durch Elektroporation von einer virenspezifischen TCR mRNA generiert wurden, beitragen. Die hierzu durchgeführten Chrom-Freisetzungs-Versuche zeigten eine vergleichbare Lyse von mit Peptid beladenen Targetzellen, durch die reprogrammierten CD8+ T-Zellen und Peptid stimulierten CTL-Linien. Weder für die reprogrammierten T-Zellen noch für die stimulierten CTL-Linien konnte ein Einfluss auf die Replikation des Laborstammes NL4-3 gefunden werden.

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