Untersuchung von zytotoxischem Effekt und Wirkmechanismus verschiedener Nicht-nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitoren

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2016-03-24
Issue Year
2016
Authors
Ries, Sonja
Editor
Abstract

2 Summary

2.1 Background and Purpose The treatment of HIV-infected patients consists of a combination of at least three antiretroviral drugs. This combination of drugs (HAART) seems to be associated with a decline of anal and cervical dysplasia in HIV-1-infected patients. As an antitumorigenic effect of Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTI) like Efavirenz has already been demonstrated in vitro, one might conclude that NNRTIs are responsible for these effects. In the following, the cytotoxic effect of Efavirenz and five other NNRTIs will be studied. Furthermore, the mechanism of the antineoplastic effect of this drug will be investigated.

2.2 Methods The NNRTIs Efavirenz (EFV), Nevirapine (NVP), Rilpivirine (RPV), Etravirine (ETR), Delavirdine (DLV) and Lersivirine (LSV) were studied. A pancreatic cancer cell line (BxPC-3) was treated with these drugs and cell death was evaluated with flow cytometry. Annexin-V-APC/7AAD and Hoechst provided insight into apoptosis, necrosis and cell cycle distribution. Furthermore, colonogenic assays were carried out with Efavirenz and Rilpivirine in order to confirm the results of the flow cytometric analyses. The mechanism of action was examined with Western Blots. The pancreatic cancer cell line BxPC-3 and the glioblastoma cell line T98G, which had previously been treated with Efavirenz, were used. The phosphorylation of the growth factors Akt and Erk and the tumor suppressor protein p53 was studied.

2.3 Results A remarkable cytotoxic effect on tumor cells was demonstrated by flow cytometry for every NNRTI mentioned above. The percentage of dead cells increased with increasing doses of the drugs. The EC50 of the different NNRTIs were: EFV: 31,5mol/l, NVP: 239mol/l, ETR: 89,0mol/l, RPV: 24,4mol/l, LSV: 543mol/l and DLV 171mol/l. So, Efavirenz and Rilpivirine were cytotoxic at the lowest concentrations compared to the other NNRTIs. In the colonogenic assays the EC50 of the survival fraction was 40M for EFV and 16M for RPV and the EC50 of the colony area was 28M for EFV and 12M for RPV. When cell death was distinguished between apoptosis and necrosis, the apoptotic fraction of cells increased with rising drug doses. As soon as definite cytotoxic doses were reached, the necrotic fraction dominated. Moreover, flow cytometry provided information on the influence of NNRTIs on the cell cycle. Initially, the fraction of cells in G1/G0-phase grew with increased doses, while the percentage of cells in S- and G2/M-phase decreased. 20M EFV led to an increase of G1/G0 by 14%, and a decrease of S-Phase by 12% and G2-phase by 2%. 10M ETR caused an increase of G1/G0 by 21% and a decrease of S-Phase by 11% and G2 by 10%, which is the most significant result of this test series. Further escalation of drug doses led to an aggregation of cells in subG1-phase. Western Blot analyses indicated a reduced the phosphorylation of pAkt-308 in BxPC-3 after Efavirenz treatment. However, EFV did not influence other phosphorylation sites of the growth factors Erk and Akt in BxPC-3 and T98G. Furthermore, it increased phosphorylation of the tumor suppressor protein p53 in glioblastoma cells.

2.4 Conclusion Taking into account that NNRTIs lead to a remarkable cell death of tumor cells, it might be possible to use them as chemotherapeutic drugs against cancer. The decreased activation of growth factor Akt in BxPC-3 and increased phosphorylation of p53, which causes an activation of the tumor suppressor protein, maintains the observation that Efavirenz is toxic against cancer cells. Nevertheless, one has to consider that the cytotoxic doses, which were experimentally determined, are often higher than drug levels of NNRTIs in HIV/AIDS- therapy. Only the EC50 of EFV was close to the drug levels in HIV-infected patients. An escalation of doses might lead to a higher rate of adverse events. So it seems rather improbable to use the other NNRTIs as chemotherapeutic drugs. The treatment of cancer with Efavirenz and a possible dose escalation should be studied in clinical trials.

Abstract

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele HIV-1-infizierte Patienten werden aus einer Kombination aus mindestens drei antiretroviralen Medikamenten behandelt. In Verbindung mit dieser Kombinationstherapie (HAART) konnte auch ein Rückgang von analen und zervikalen Dysplasien bei HIV-Infizierten verzeichnet werden. Da ein tumortoxischer Effekt des Nicht-nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitors (NNRTI) Efavirenz, der ein häufiger Bestandteil der HAART ist, in vitro bereits nachgewiesen wurde, lässt dies Grund zur Annahme, dass diese Wirkstoffe ursächlich für die Rückbildung der Präkanzerosen sind. Im Folgenden soll untersucht werden, ob die sechs verschiedenen NNRTI einen zytotoxischen Effekt bei Tumorzellen in vitro aufweisen. Außerdem ist es Ziel dieser Arbeit, den Wirkmechanismus zu analysieren, der für die antineoplastische Wirkung verantwortlich ist.

1.2 Methoden Innerhalb der Medikamentengruppe der NNRTI wurde der zytotoxische Effekt der Wirkstoffe Efavirenz (EFV), Nevirapin (NVP), Rilpivirin (RPV), Etravirin (ETR), Delavirdin (DLV) und Lersivirin (LSV) auf die Pankreastumorzelllinie BxPC-3 anhand flusszytometrischer Messungen untersucht. Durch Färbung mit Annexin-V-APC/7AAD und Hoechst 33342 wurden hierbei Informationen hinsichtlich Apoptose, Nekrose und Zellzyklusphasen gewonnen. Anschließend wurden Koloniebildungstests für Efavirenz und Rilpivirin durchgeführt, um die Ergebnisse der flusszytometrischen Messungen zu verifizieren. Mithilfe von Western Blots sollte der Wirkmechanismus der NNRTI weiter erforscht werden. Hierfür wurden Pankreastumorzellen (BxPC-3) sowie Glioblastomazellen (T98G), die zuvor mit Efavirenz behandelt wurden, verwendet. Beurteilt wurde die Phosphorylierung der Wachstumsfaktoren Erk und Akt sowie des Tumorsupressorproteins p53.

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Alle untersuchten NNRTI zeigten in den flusszytometrischen Messungen eine dosisabhängige Zunahme der Summe apoptotischer und nekrotischer Zellen. Die EC50 der verschiedenen Wirkstoffe betrug: EFV: 31,5mol/l, NVP: 239mol/l, ETR: 89,0mol/l, RPV: 24,4mol/l, LSV: 543mol/l und DLV 171mol/l. Somit war die antineoplastische Wirkung bei EFV und RPV im Vergleich zu den anderen NNRTI bei den niedrigsten Dosierungen nachweisbar. Durch die flusszytometrischen Messungen konnte eine Differenzierung zwischen Apoptose und Nekrose erfolgen. Der Anteil der apoptotischen Zellen nahm mit steigender Dosis zunächst zu. Bei Erreichen deutlich zytotoxischer Konzentrationen dominierte der Anteil nekrotischer Zellen. In den Koloniebildungstests betrug die EC50 der Überlebensratio für EFV 40M und für RPV 16M und die EC50 der Kolonieflächen 28M für EFV und 12M für RPV. Mithilfe der flusszytometrischen Messungen konnte außerdem der Einfluss der Medikamente auf den Zellzyklus dargestellt werden, wobei sich mit steigender Dosis zunächst eine Zunahme der Zellen in der G1/G0-Phase mit gleichzeitiger Reduktion der S- und G2/M-Phase manifestierte. Für EFV bewirkte die Dosis 20M einen Anstieg von G1/G0 um 14%, bei gleichzeitigem Rückgang der S-Phase um 12% und der G2-Phase um 2%. Am deutlichsten war dieses Ergebnis bei ETR in der Dosis 10M mit einem Zuwachs von G1/G0 um 21% und Abnahme der S-Phase um 11% sowie G2 um 10%. Eine weitere Erhöhung der Dosis ließ den Anteil der Zellen in subG1- Phase deutlich ansteigen. In den Western Blots führte EFV zu einer leichten Abnahme der Bandenfärbung von pAkt-308 bei BxPC-3. Die restlichen Phosphorylierungsstellen von Akt und Erk bei BxPC-3 und T98G wurden nicht beeinflusst. Außerdem verursachte EFV eine gesteigerte Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins p53 in T98G-Zellen.

1.4 Praktische Schlussfolgerungen Aufgrund der Tatsache, dass NNRTI bereits bei niedrigen Konzentrationen zu einem beträchtlichen Absterben von Tumorzellen führen, wäre ein Einsatz dieser Medikamentengruppe in der Tumortherapie durchaus denkbar. Besonders Efavirenz, das auch bei Patienten relativ hohe Blutspiegel erreicht, wäre prinzipiell gut geeignet. Die Aktivitätsabnahme von Akt in BxPC-3 sowie die gesteigerte Phosphorylierung von p53, die eine Aktivierung des Tumorsuppressorgens bewirkt, unterstützen die Beobachtung, dass Efavirenz antineoplastisch wirkt. Allerdings muss hierbei berücksichtigt werden, dass die experimentell ermittelten zytotoxischen Dosierungen der übrigen NNRTI über den momentan zugelassenen bzw. empfohlenen Dosierungen in der HIV/AIDS-Therapie liegen. Diese Ergebnisse unterstützen den Einsatz von Efavirenz zur Tumortherapie innerhalb klinischer Studien.

DOI
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