Tetracycline regulates transcription and translation of tetO by stabilizing alternative folds of the leader RNA

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2014-11-10
Issue Year
2014
Authors
Heidrich, Corina
Editor
Abstract

Antibiotics belonging to the tetracycline family are characterized by their exceptional efficacy against many Gram-positive and Gram-negative bacteria, atypical bacteria such as rickettsia, chlamydia and mycoplasma and some protozoan parasites. Tetracyclines inhibit bacterial protein synthesis by binding to the 30S ribosomal subunit, thereby preventing stable accommodation of aminoacylated-tRNA at the ribosomal A-site. The extensive use has strongly limited their efficacy as antimicrobials due to the concomitant emergence and spread of microbial resistance. The most widely studied resistance mechanisms include active export of the antibiotic by efflux proteins and ribosomal protection proteins. The ribosomal protection protein TetO mediates resistance to tetracycline by promoting release of the antibiotic from the ribosome. But, since TetO and the elongation factor EF G bind to the same site on the ribosome, a high cellular concentration of TetO interferes with translation and is, thus, toxic for the cells. Hence, TetO expression needs to be tightly regulated. It already has been shown that the expression of tetO is induced by tetracycline and regulated by the 5´-untranslated region (5´-UTR) located directly upstream of the tetO start codon at the level of transcription and translation. Based on mutagenic studies and exhaustive RNA structure analysis, the different leader RNA conformations allowing tetracycline-mediated regulation of tetO expression were identified and characterized. This made it possible to establish a model according to which the expression of tetO is regulated by the formation of three RNA-structures. In the absence of tetracycline, an intrinsic transcription terminator prohibits the expression of tetO. Any non-terminated, read-through transcript adopts a conformation preventing subsequent translation of tetO. In it, the tetO ribosomal initiation site is occluded in a stem-structure stabilized by a pseudoknot interaction. The formation of these two leader RNA structures efficiently suppresses TetO synthesis in the absence of tetracycline. Only the presence of tetracycline stabilizes formation of an alternative RNA structure allowing both transcription and translation of the tetO open reading frame. In addition to the regions, which, due to their alternative sequence complementarity, provide the basis for leader RNA mediated regulation of tetO expression, a short upstream open reading frame (uORF) is also located in the 5´-region of the tetO leader sequence. The presence of this leader peptide sequence had already been shown to be required for tetracycline-mediated induction of tetO expression. However, the data obtained in this study strongly suggest that tetracycline induces tetO expression by directly contacting the nascent leader transcript and not just by stalling the ribosome at the uORF. These findings suggest a novel combined regulatory mechanism involving a ribosome as sensor and transmitter of tetracycline to the tetO leader RNA to initiate the expression of tetO via a tetracycline-dependent riboswitch. The structure elements required for tetracycline-mediated regulation of tetO expression are highly conserved among the 5´-UTRs of other ribosomal protection protein determinants. Thus, it seems reasonable to assume that their expression is accomplished by a common regulatory mechanism.

Abstract

Tetrazykline hemmen nicht nur die Proteinbiosynthese vieler Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, sondern wirken auch gegen zellwandlose Mycoplasmen, Rickettsien, Clamydien und einige protozoische Parasiten. Sie binden an die 30S Untereinheit der Ribosomen und verhindern dadurch die stabile Anlagerung der Aminoacyl-tRNA. Der umfangreiche und leider oftmals auch unbedachte Einsatz dieser Antibiotika führte zur Resistenzentwicklung in vielen Organismen. Dabei sind die aktive Ausschleusung des Wirkstoffs durch Efflux-Proteine und die ribosomalen Schutzproteine die am weitesten verbreiteten und die am besten untersuchten Resistenzmechanismen. Das ribosomale Schutzprotein TetO vermittelt Tetrazyklin-Resistenz, indem es an das Ribosom bindet. Die dadurch hervorgerufene Konformationsänderung bewirkt die Freisetzung von Tetrazyklin aus seiner Bindetasche. Da TetO das Ribosom an der gleichen Stelle bindet wie der Elongationsfaktor EF-G, wirkt es in hohen Konzentrationen toxisch. Um das Zellwachstum nicht zu beeinträchtigen, ist daher eine stringente Kontrolle der TetO-Expression essentiell. Es wurde bereits gezeigt, dass die Expression von TetO durch den 5´-untranslatierten Bereich (5´-UTR) stromaufwärts von tetO (tetOup) auf Transkriptions- und Translationsebene kontrolliert und durch Tetrazyklin induziert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mittels Mutagenesestudien sowie in silico, in vitro und in vivo RNA-Strukturanalysen die an der Expressionsregulation beteiligten alternativen Konformationen der tetO leader RNA identifiziert und charakterisiert. In dem auf diesen Erkenntnissen entwickelten Modell wird die Expression von tetO durch die Ausbildung von drei RNA-Strukturen reguliert. Dabei wird in Abwesenheit von Tetrazyklin überwiegend die RNA-Konformation stabilisiert, in welcher die Ausbildung des Transkriptionsterminators zum vorzeitigen Abbruch der mRNA-Synthese von tetO führt. Nicht terminiertes Transkript bildet eine Faltung aus, in welcher die Shine-Dalgarno Sequenz von tetO in einen pseudoknot-stabilisierten, helicalen Bereich eingeschlossen und somit für das Ribosom unzugänglich wird. Diese beiden RNA-Strukturen zusammen gewährleisten die effektive Abschaltung der tetO-Expression in Abwesenheit von Tetrazyklin. In Anwesenheit von Tetrazyklin kommt es zur Ausbildung einer alternativen leader RNA-Struktur, welche sowohl die Transkription als auch die Translation von tetO erlaubt. Neben den Bereichen in der 5´-UTR, welche, aufgrund ihrer alternativen Sequenzkomplementarität, die unterschiedlichen Faltungen der leader RNA und somit die Regulation der tetO Expression ermöglichen, befindet sich auch ein kurzer offener Leserahmen (uORF) in der Leadersequenz. Verschiedene Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Präsenz des Ribosoms an diesem uORF wichtig für die Tetrazyklin-vermittelte tetO Expression ist, die Faltung der entsprechenden leader RNA-Struktur jedoch durch direkte Wechselwirkungen von Tetrazyklin mit der naszierenden leader RNA induziert wird. Diese Charakteristika implizieren einen neuartigen Mechanismus RNA-basierter Genregulation, bei dem das Ribosom als Sensor und als Überträger von Tetrazyklin auf die leader RNA fungiert und dadurch die Expression von tetO über einen Tetrazyklin-abhängigen Riboswitch initiiert. Da die an der Tetrazyklin-vermittelten Regulation der tetO Expression involvierten Bereiche auch in den stromaufwärts liegenden Sequenzen von anderen Resistenzdeterminanten für ribosomale Schutzproteine vorkommen, liegt die Vermutung nahe, dass ihrer Expressionsregulation ein gemeinsamer Mechanismus zugrunde liegt.

DOI
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