Trivalente Präsentation von Peptiden am Beispiel von HIV-1 gp120

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2014-08-29
Issue Year
2014
Authors
Berthelmann, Arne
Editor
Abstract

Multivalent interactions play an important role in biology, for example in the interaction of viruses like influenza or the human immunodeficiency virus (HIV) and their host cells. Within multivalent interactions, trimeric systems are often represented. Trivalent ligands can be used to investigate or to influence these biological systems. Therefore, strategies for the trivalent presentation of peptides were developed and compared to each other. Binding of the viral surface protein gp120 to CD4 on the host cell represents the first step in the infection with HIV. Since gp120 is presented as a trimer on the viral surface, the trivalent presentation of peptides derived from gp120 could lead to potential inhibitors or synthetic immunogens. The gp120 V3 loop was chosen to investigate the effect of a trivalent presentation of peptides. Two different strategies for the trivalent presentation of peptides were compared. On the one hand a trimerisation domain (foldon) was used to design noncovalent peptide trimers. On the other hand different scaffolds were used, which were connected covalently with three V3 loop peptides. To generate noncovalent V3 loop trimers, the trimerisation domain foldon was linked with to V3 loop peptides by thioether ligation. For the synthesis of the covalent V3 loop trimers different linear and one cyclic peptide, as well as two C3-symmetric, on trimesic acid based, scaffolds were used. The scaffolds were connected to the V3 loop peptides by thioether ligation or 1,3-dipolar cycloaddition. By this means, different noncovalent and covalent V3 loop trimers were synthesized and could be used in binding assays afterwards. The anti-V3 loop antibody 447-52D was chosen for the characterization of the binding behavior of the V3 loop peptides. This antibody is one of the most potent anti-V3 loop antibodies and recognizes a range of different V3 loop sequences. Binding of the trivalent V3 loop peptides to the antibody was investigated and compared to the V3 loop monomers. The noncovalent (via foldon) V3 loop trimers showed an enhanced binding affinity, but the effect was not very distinct. The noncovalent trimers had in the best case a 24-fold higher affinity compared to the monomer. All covalent V3 loop trimers, on the other hand showed an enhanced binding affinity compared to the V3 loop monomers with up to 500-fold better affinities. Whereby the C3 symmetric V3 loop trimers provided the best results with over 500 fold higher affinities. Thus the covalent, C3 symmetric presentation represents the best strategy for the trivalent presentation of (V3 loop) peptides. One of the covalent trivalent V3 loop trimers (gp120 SF162) was used as an immunogen in mice. The resulting anti-V3 loop sera recognized the trivalent immunogen, but showed also a comparable binding to the monomeric V3 loop peptide. Thus, it was not possible to generate trimer specific antibodies with the trivalent immunogen. Next binding of the sera to gp120 SF162, the template for the immunogen, was investigated. All sera recognized gp120, but especially one serum showed a strong binding to gp120. This serum recognized also the gp120 strains BAL, ADA (R5 tropic) and MN (X4 tropic), but not the strains HxBc2 and IIIB (X4 tropic). The last two ones have an insertion of two amino acids (QR) within the V3 loop, which lead to a conformational change in the V3 loop. This conformational change may have prevented binding to these two gp120 strains. Taken together, it could be demonstrated that the trivalent V3 loop immunogen could generate antibodies which recognized different gp120 strains and therefore showed a cross reactivity.

The binding studies with the trivalent V3 loop peptides indicated a decreased stability of the foldon trimer at low concentrations, which in turn affected the binding affinities of the V3 loop peptides. Therefore, in the second part of this work, the question was addressed, whether the stability of the foldon trimer could be enhanced by linking the Foldon monomers covalently to a suitable scaffold, while maintaining its correct fold. The foldon trimer has a C3 symmetric structure, for that reason also C3 symmetric scaffolds were used for the covalent stabilization of the foldon trimer. Overall four covalently stabilized foldon trimers were synthesized. Afterwards the covalent foldon trimers were characterized regarding their folding, structure and stability and compared to the foldon wildtype. CD spectra of the four covalent foldon trimers and foldon wildtype indicated that the folding of the foldon was not affected by the covalent attachment to the scaffold. These results were further corroborated by solving the crystal structures of two of the four covalent foldon conjugates. Both structures showed only slightly differences compared to the foldon wildtype structure. Finally the thermal stability of the foldon peptides were determined by CD spectroscopy. Even under general denaturing conditions (5 M urea) all covalently stabilized trimers were substantially more stable, with an approximately 30 °C higher melting point than that of the foldon wildtype. These results demonstrate the strong stabilization of the foldon trimer by covalent attachment to a scaffold, while maintaining its natural fold. Altogether it could be demonstrated impressively, that the trivalent presentation of peptides represents a powerful tool to enhance the binding affinity or the stability, respectively of these trimeric peptides compared to the corresponding monomeric peptides.

Abstract

Multivalente Interaktionen spielen in der Biologie, beispielsweise bei der Interaktion zwischen Viren, wie Influenza oder dem Humanen-Immunodefizienz-Virus (HIV), und ihren Wirtszellen eine wichtige Rolle. Innerhalb der multivalenten Interaktionen wiederum sind häufig trimere Moleküle vertreten. Um diese Systeme zu untersuchen bzw. zu beeinflussen, bietet es sich an, entsprechend trivalente Peptidliganden einzusetzen. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit Strategien zur trivalenten Präsentation von Peptiden entwickelt und miteinander verglichen. Den initialen Schritt in der Infektion mit HIV stellt die Bindung des viralen Oberflächenproteins gp120 an CD4 auf der Wirtszelle dar. Da gp120 auf der Virusoberfläche als Trimer präsentiert wird, ist die trivalente Präsentation von gp120 abgeleiteten Peptiden als potentielle Inhibitoren oder synthetischen Immunogenen naheliegend. Für die Untersuchung des Effektes der trivalenten Peptidpräsentation wurde der V3 loop von gp120 ausgewählt. Zur trivalenten Präsentation von V3 loop Peptiden wurden zwei verschiedene Strategien auf ihr Potential hin miteinander verglichen. Einerseits wurde eine Trimerisierungsdomäne (Foldon) eingesetzt, die eine nicht-kovalente Trimerisierung der Peptide ermöglichen sollte. Andererseits wurden verschiedene Gerüste genutzt, die kovalent mit drei V3 loop Peptiden verknüpft wurden. Um nicht-kovalente V3 loop Trimere zu generieren, wurde die Trimerisierungdomäne Foldon mit den V3 loop Peptiden mittels Thioether-Ligation verknüpft. Für die Synthese von kovalenten V3 loop Trimeren wurden verschiedene lineare und ein zyklisches Peptid, sowie zwei C3 symmetrische, auf Trimesinsäure basierende, Gerüste eingesetzt. Die Gerüste wurden ebenfalls mittels Thioether-Ligation oder 1,3-dipolarer Cycloaddition mit den V3 loop-Peptiden verknüpft. Auf diese Weise konnten verschiedene nicht-kovalente und kovalente V3 loop Trimere synthetisiert und anschließend in Bindungsstudien eingesetzt werden. Für die Charakterisierung des Bindungsverhaltens der V3 loop-Peptide wurde der anti V3 loop Antikörper 447 52D als Bindungspartner ausgewählt. Bei diesem Antikörper handelt es sich um einen der potentesten anti V3 loop Antikörper, der in der Lage ist, verschiedenste V3 loops zu erkennen. Die verschiedenen trivalenten V3 loop Peptide wurden auf ihr Bindungsverhalten gegenüber dem Antikörper 447 52D untersucht und mit den entsprechenden V3 loop Monomeren verglichen. Die über die Foldon-Trimerisierungsdomäne trivalent präsentierten V3 loop-Peptide zeigten zwar eine höhere Affinität gegenüber dem Monomer, allerdings war der Effekt nicht sehr deutlich ausgeprägt. So wiesen die nicht-kovalenten Trimere eine im besten Fall nur 24-fach bessere Affinität gegenüber dem Monomer auf. Ursache hierfür ist wahrscheinlich die bei niedrigen Konzentrationen (nanomolarer Bereich) geringe Stabilität des Foldon-Trimers. Bei den kovalenten V3 loop Trimeren zeigten alle Peptide deutlich gesteigerte Bindungsaffinitäten gegenüber den entsprechenden Monomeren mit bis zu 500 fach erhöhten Affinitäten. Hierbei hoben sich die C3 symmetrischen V3 loop Trimere gegenüber allen anderen kovalenten Trimeren mit über 500 fach besseren Affinitäten deutlich ab. Somit stellt die kovalente, C3-symmetrische Präsentation die beste Strategie für die trivalente Präsentation von (V3 loop)-Peptiden dar. Abschließend wurde ein trivalentes V3 loop Peptid (gp120 SF162) als Immunogen in Mäusen eingesetzt. Die resultierenden anti-V3 loop-Seren waren in der Lage, das trivalente Immunogen zu erkennen, zeigten jedoch auch eine vergleichbare Bindung an das entsprechend monomere V3 loop Peptid. Somit war es nicht möglich, mit dem trivalenten Immunogen trimerspezifische Antikörper zu generieren. Im nächsten Schritt wurde die Bindung der anti V3 loop Seren an gp120 SF162, von dem das Immunogen abgeleitet wurde, untersucht. Alle Seren waren in der Lage gp120 zu erkennen, jedoch zeigte insbesondere ein Serum eine sehr starke Bindung an gp120. Daraufhin wurden nur mit diesem Serum weitere Test durchgeführt. Das Serum war ebenfalls in der Lage, die gp120-Stämme BAL, ADA (R5 trop) und MN (X4 trop), nicht jedoch HxBc2 und IIIB (X4 trop) zu erkennen. Die beiden zuletzt genannten Stämme weisen innerhalb des V3 loops eine Insertion von zwei Aminosäuren (QR) auf, die zu einer konformationellen Änderung innerhalb des V3 loops führt, die wahrscheinlich die Bindung des Serums an diese beiden gp120-Stämme verhindert. Damit konnte insgesamt demonstriert werden, dass das trivalente V3 loop Immunogen in der Lage war, Antikörper zu generieren, die verschiedene gp120-Stämme erkennen und damit eine Kreuzreaktivität aufweisen. Dies ist ein erster wichtiger Schritt in Richtung eines erfolgreichen Vakzins, das in der Lage ist, Antikörper hervorzurufen, die HIV neutralisieren, d.h. eine Infektion mit HIV verhindern können.

Wie sich bei den Untersuchungen mit den trivalenten V3 loop-Peptiden herausstellte, scheint das Foldon bei niedrigen Konzentrationen eine geringere Stabilität hinsichtlich der Ausbildung des Trimers zu haben, was wiederum die Bindungsaffinitäten beeinflusste. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob die Stabilität des Foldon-Trimers durch die kovalente Verknüpfung mit einem geeigneten Gerüst, unter gleichzeitiger Beibehaltung der nativen Faltung, erhöht werden kann. Da es sich bei dem Foldon-Trimer um eine C3 symmetrische Struktur handelt, wurden auch C3 symmetrische Gerüste für die Synthese der kovalent stabilisierten Foldon-Konjugate eingesetzt. Insgesamt wurden vier verschiedene kovalent stabilisierte Foldon-Trimere synthetisiert. Anschließend wurden die kovalenten Foldon-Trimere hinsichtlich ihrer Faltung, Struktur und Stabilität untersucht und mit dem Foldon-Wildtyp verglichen. CD Spektren der vier kovalenten Foldon-Konjugate und des Wildtyps deuteten darauf hin, dass die Faltung der Foldon-Trimere durch die Verknüpfung mit den Gerüsten nicht beeinflusst wurde. Um dies weiter zu bestätigen, wurde versucht, die kovalenten Foldon-Konjugate zu kristallisieren und deren Kristallstruktur zu bestimmen. Dies gelang für zwei der vier kovalenten Foldon-Konjugate. Die Kristallstrukturen bestätigten die Ergebnisse aus den CD Messungen. Die Strukturen der beiden kovalent stabilisierten Foldon-Trimere wiesen nur geringfügige Abweichungen zu der Struktur des Wildtyps auf. Abschließend wurde die thermische Stabilität der vier kovalenten Foldon-Konjugate mittels CD-Spektroskopie bestimmt. Hierbei zeigten alle vier kovalent stabilisierten Konjugate unter generell denaturierenden Bedingungen (5 M Harnstoff) einen um fast 30 °C höheren Schmelzpunkt als der Foldon-Wildtyp. Zusammengenommen demonstrieren diese Ergebnisse die hohe Stabilisierung des Foldon-Trimers durch die kovalente Verknüpfung mit den Gerüsten unter gleichzeitiger Beibehaltung der nativen Faltung des Foldon-Trimers.

Insgesamt konnte eindrucksvoll demonstriert werden, dass die trivalente Präsentation von Peptiden ein leistungsstarkes Werkzeug darstellt, die Bindungsaffinität bzw. die Stabilität dieser trimeren, im Vergleich zu den entsprechend monomeren Peptiden, zu erhöhen.

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