Design, Synthese und Analytik peptidischer CD4-Mimetika sowie Analyse ihrer Bindung an das HIV-Hüllprotein gp120

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2013-08-23
Issue Year
2013
Authors
Meier, Julia
Editor
Abstract

The interaction of the HIV surface protein gp120 with the immune cell receptor CD4 is the first step of the virus entry in the host cell. Molecules which are able to interrupt this interaction are promising candidates as entry inhibitors. Peptides mimicking the binding site of CD4 for gp120 could be the starting point for the development of new HIV entry inhibitors. Based on the x-ray crystal structure of the gp120-CD4 complex, such peptides were designed. The peptides were synthesized by solid phase peptide synthesis. Two methods for the peptide cyclisation were attempted: lactam and disulfide cyclisation. The insertion of cysteins and their connection by disulfide bridges turned out to be a successful method to obtain cyclic peptides. In an attempt to detect the binding of CD4 to gp120 and to explore the affinity of CD4 mimetic peptides to gp120, appropriate ELISA conditions were established. The key role of CD4 residues Phe-43 and Arg-59 in the gp120-CD4 interaction was confirmed for the first time at the peptide level. The highest contribution to binding to gp120 comes from Phe-43, followed by Arg-59. By means of peptide variants F43W and F43Nal it was shown that larger aromatic residues at position 43 may increase binding to gp120 because of a larger interaction surface between the residue at position 43 and the hydrophobic cavity of gp120 in which Phe-43 protrudes. ELISA binding tests demonstrated stronger binding of gp120 for cyclic CD4 mimetics than for linear ones. The increased conformational stability through cyclisation of peptides was although evidenced by molecular dynamics stimulations of peptide-gp120 complexes. Here the cyclic peptide shows a similar conformational stability to the respective region in CD4. Thereby, the cyclic mimetics of hCD4 22- 64 bind gp120 better than the cyclic mimetics of the CDR2 like loop only, re-confirming the importance of Arg-59 which is missing in CDR2 like loop peptides. The binding specificities of all peptides were confirmed by alanine substitution variants: the exchange of key amino acids Phe-43 and Arg-59 by alanine lead to a complete lost of binding to gp120. Furthermore, the results of an induction assay involving the cyclic peptide mimicking the CDR2 like loop of CD4, suggest that the peptide may trigger a conformational change within gp120 similar to CD4. This change is needed to expose the coreceptor binding site of gp120, enabling contact with the coreceptor and, consequently, entry of HIV into the host cell. This result indicates a functional mimicry of CD4 by the mimetic peptides. In the second part of this work the lack of affinity of murine CD4 to gp120, as well as to a peptide that mimicks the CD4 binding site of gp120, was shown in ELISA binding experiments, which is in contrast to human CD4. Peptides presenting the putative gp120 binding site of murine CD4 were synthesized and compared in terms of gp120 binding. Thereby it was found that the lacking affinity of murine CD4 to gp120 could be restored in mimetic peptides, whose affinities to gp120 are similar to the corresponding human CD4 mimetic peptides. Likewise, cyclization of the murine CD4 mimetic increased binding to gp120. Consequently, neither the “murinized” human nor the “humanized” murine peptides showed a binding behavior different from the respective wt-peptides. Molecular dynamics simulations indicate that the mCD4-peptide stably interacts with gp120 via an intermolecular β-sheet. Introducing a disulfide bridge between the N- and C-termini in the peptides significantly enhanced the affinity to gp120 due to stabilization of the salt-bridge between Lys-61 (CD4-peptide) and Asp-368 (gp120). Inhibition of the gp120-CD4 interaction represents an attractive strategy to block HIV-1 infection. In this work, binding experiments confirm the notion that peptide mimetics of binding site of CD4 for gp120 have potential to be developed as HIV-1 entry inhibitors.

Abstract

Die Interaktion des HIV-Hüllproteins gp120 mit dem Immunzellrezeptor CD4 ist der erste Schritt des Viruseintritts in die Wirtszelle. Moleküle, die in der Lage sind diese Interaktion zu hemmen, sind vielversprechende Kandidaten für sogenannte Eintrittsinhibitoren. Peptidische Mimetika der gp120-Bindungsstelle von CD4 können einen Ausgangspunkt für die Entwicklung neuartiger HIV-Eintrittsinhibitoren darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Peptide ausgehend von der Röntgen-Kristallstruktur des gp120-CD4-Komlexes designed, die die Interaktionsfläche des T-Zell-Rezeptors CD4 für das HIV-Hüllprotein gp120 nachahmen. Die Peptide wurden mit Hilfe der Festphasenpeptidsynthese hergestellt. Bei der Synthese zyklischer Peptide wurden zwei methodische Ansätze zur Zyklisierung verfolgt: die Lactam- und die Disulfidbücke. Dabei konnte die Letztere erfolgreich umgesetzt werden. Es wurden geeignete ELISA-Bedingungen zur Darstellung der CD4-gp120 Interaktion und der Bindung peptidischer Mimetika an gp120-Proteine etabliert. Dabei konnten die Schlüsselrollen der CD4-Aminosäuren Phe-43 und Arg-59 erstmals auf Peptidebene nachvollzogen werden. Der Beitrag dieser Reste konnte mit Hilfe geeigneter Alanin-Varianten in ELISA-Experimenten erfasst werden. Hierbei zeigte sich, dass Phe-43 den größten Beitrag zur Interaktion mit gp120 leistet. Mit Hilfe von F43W- und F43Nal-Varianten konnte gezeigt werden, dass größere aromatische Reste an der Aminosäureposition 43 zu einer besseren Bindung dieser Varianten an gp120 führen. In den ELISA-Bindungstests zeigten zyklische CD4-Mimetika deutlich höhere Bindungen an gp120 als deren lineare Analoga. Die Moleküldynamik Simulationen bestätigten die erhöhte konformationelle Stabilität eines zyklischen Peptides, das an der Kontaktfläche mit gp120 ähnlich stabil, wie der entsprechende Bereich im CD4-Protein, ist. Unter den zyklischen Mimetika war das der hCD4-Positionen 22 bis 64 dem zyklischem Mimetikum der CDR2-ähnlichen Schleife hinsichtlich der Bindung an gp120 in ELISA-Tests überlegen, was einen weiteren Hinweis auf die wichtige Rolle von Arg-59, das im kürzeren Peptid fehlt, gibt. Die Spezifität der Bindungen aller Peptide konnte durch die Alanin-Varianten bestätigt werden, da diese wegen Austausch von Phe-43 und Arg-59 durch Alanine nicht von gp120 gebunden wurden. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse eines sog. Induktions-ELISA darauf hin, dass das Mimetikum der CDR2-ähnlichen Schleife eine CD4-ähnliche Konformationsänderung im gp120 auslösen kann. Diese Änderung ist nötig, um die Corezeptorbindungsstelle im gp120 zu öffnen, um dann den Corezeptor zu binden, um letztendlich in die Wirtszelle einzudringen. Dieses Ergebnis ist ein Hinweis auf eine funktionelle Mimikry von CD4 durch die mimetischen Peptide. Im zweiten Teil der Arbeit konnte im ELISA-Format gezeigt werden, dass murines CD4 im Gegensatz zum humanen CD4 weder gp120 selbst noch ein Mimetikum der CD4-Bindungsstelle von gp120 bindet. Es wurden Mimetika des murinen CD4 hergestellt und mit den entsprechenden humanen CD4-Mimetika im Hinblick auf die gp120-Bindung im ELISA verglichen. Hierbei wurde festgestellt, dass die auf der Proteinebene beobachtete Speziesselektivität von gp120 bezüglich humanem und murinem CD4 auf der Peptidebene aufgehoben wird, denn die Mimetika des murinen CD4 zeigten eine ähnliche Bindungsstärke zu gp120 wie die entsprechenden humanen Peptide. Dabei zeigte die zyklische Variante des mCD4-Mimetikums eine signifikant höhere Bindung als die linearen. Weder die „Murinisierung“ der hCD4-Mimetika noch die „Humanisierung“ der mCD4-Mimetika brachten wesentliche Unterschiede bezüglich der gp120-Bindung mit sich. Moleküldynamik Simulationen zeigten, dass das lineare Mimetikum des murinen CD4 und gp120 durch Ausbildung eines intermolekularen β-Faltblattes eine stabile Interaktion eingehen. Außerdem konnte die im Bindungstest beobachtete stärkere Bindung zyklischer Peptide durch die Stabilisierung der Salzbrücke zwischen Lys-61 (CD4) und Asp-368 (gp120) erklärt werden. Es lässt sich schlussfolgern, dass das Fehlen der Affinität von mCD4 an gp120 nicht auf der Aminosäuresequenz, sondern auf der Sekundärstruktur beruht. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sind Experimente durchgeführt worden, die belegen, dass peptidische Mimetika des humanen CD4s aufgrund der hier gezeigten Bindung an gp120 durchaus Potential als Eintrittsinhibitoren besitzen. Um diesem Ziel näher zu kommen, sollten die in dieser Arbeit synthetisierten Peptide chemisch weitermodifiziert werden, damit sie mit einer höheren Affinität zu gp120 mit Rezeptor CD4 um die gp120-Bindung konkurrieren können. Eine stärkere Affinität eines solchen Peptides sollte somit die Bindung des Rezeptors CD4 an das HIV-Hüllprotein und somit den Viruseintritt verhindern.

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