Bedeutung von Rho-Kinasen für das Genexpressions- und Migrationsverhalten mikrovaskulärer Endothelzellen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2013-03-08
Issue Year
2012
Authors
Breyer, Johannes
Editor
Abstract

Introduction: Rho-associated kinases (ROCK) which are expressed ubiquituous play an important role in the regulation of various cellular functions. Especially the actin cytoskeleton, cell-cell-contacts, cell-matrix-contacts, cellular contractility and cell migration are modulated by them. The functions of the Rho-kinases are exercised through phosphorylation of MYPT, LIM-kinases and Cofilin, and through the gene expression product connective tissue growth factor (CTGF). Two isoforms of the Rho-kinases, which contain a large sequence homology, could be identified. Functions that are regulated by Rho-kinases like cell migration, sprouting and stabilisation of established vessels play a role in the regulation of angiogenesis, i.e. the establishment of a new vessel from a preexistent one. The purpose of this study was the investigation of the importance of Rho-kinases for gene expression and migration of microvascular endothelial cells. Methods: A murine glomerular endothelial cell line was used for all experiments. To inhibit the functions of the Rho-kinases unselective inhibitors against both isoforms, H1152 and Y-27632 were used. A novel inhibitor which is selectively targeted against the isoform 2, SLX2119, was used to examine the functions of isoform 2. Protein levels of CTGF, VE-cadherin and the phosphorylation level of MYPT and Cofilin were determined using western blot analysis. Immunocytochemical staining of the f-actin cytoskeleton, cell-cell-contacts and cell-matrix-contacts was performed. To determine the influence of the ROCK-inhibitors on cell migration various migration assays were performed, Boyden-chamber assay, scratch assay and barrier assay and a novel migration assay where endothelial cells migrated from a three-dimensional cell spheroid on two-dimensional matrices. Steps of the angiogenic process were examined using the matrigel-assay and the in vitro sprouting assay in collagen gel. Results: H1152 leads to a downregulation of CTGF protein levels, whereas SLX2119 only modulates CTGF protein expression, i.e. neither upregulates nor downregulates it. Both H1152 and SLX2119 comparably reduce the phosphorylation level of MYPT, phosphorylation of Cofilin is considerably more reduced by H1152 as by SLX2119. On the cytoskeletal level H1152 leads to a complete loss of cytoplasmatic f-actin fibres and to the formation of lamellipodes after 24 h. SLX2119 also leads to a loss of cytoplasmatic f-actin fibres but to nuclear accumulation, furthermore to the formation of lamellipodes and single filopodes. An impact on endothelial cell migration in the two-dimensional transmigration assays and in the lateral migration assays could be observed neither by H1152 nor by SLX2119. H1152 considerably enhances migration out of the spheroid on FN in the 3D-2D-migration assay, whereas SLX2119 only slightly enhances this. H1152 and Y-27632 lead to an enhanced structure formation on matrigel, SLX2119 only to a slight enhancement. H1152 and SLX2119 similarly reduce the cumulative length of the sprouts out of the three-dimensional endothelial cell spheroids added after four days in the in vitro sprouting assay in collagen gel. Furthermore ROCK-inhibitors lead to an enhanced appearance of single cells beneath the spheroids and to the reorganisation of these single cells to vessel-like structures. The addition of the inhibitors on day 1 leads to a reduced cumulative sprout length in some experiments by H1152; in some experiments the inhibitor did not change the cumulative sprout length. Conclusions: Both Rho-kinase isoforms comparably or predominantly isoform 1 seem to be necessary for the regulation of CTGF expression in glEND.2 cells. The phosphorylation level of MYPT is a more adequate marker for the activity of isoform 2 than the phosphorylation level of Cofilin. Inhibition of both isoforms in the 3D-2D-assay enhances cell motility by reducing cytoplasmatic f-actin and by reducing the cell-cell-contact molecule VE-cadherin. This also leads to an enhanced structure formation on matrigel. In the in vitro sprouting assay the maintenance of cytoskeletal tension is necessary for the stabilisation of established sprouts because H1152 and SLX2119 are able to dissolve the sprouts by reducing the actin cytoskeleton.

Abstract

Hintergrund und Zielsetzung: Rho-assoziierte Kinasen (ROCKs) sind ubiquitär exprimiert und spielen in der Regulation verschiedenster Zellfunktionen eine große Rolle. Durch sie werden vor allem das Aktinzytoskelett, Zell-Zell-Kontakte, Zell-Matrix-Kontakte, die Zellkontraktilität sowie die Zellmigration moduliert. Die Funktionen der ROCKs werden durch Phosphorylierung der Myosinphosphatase, der LIM-Kinasen und von Cofilin sowie über das Genexpressionsprodukt connective tissue growth factor (CTGF) ausgeübt. Es konnten zwei Isoformen der Rho-Kinasen identifiziert werden, die eine sehr große Sequenzhomologie aufweisen. Bei der Angiogenese, das heißt dem Bilden neuer Gefäße aus vorher bereits bestehenden, spielen unter anderem Funktionen, die durch Rho-Kinasen reguliert werden, wie die Zellmigration, das Aussprossen und die Stabilisierung des entstandenen Gefäßes eine Rolle. Zielsetzung der Arbeit war die Untersuchung des Einflusses der Rho-Kinasen auf die Genexpression und das Migrationsverhalten mikrovaskulärer Endothelzellen. Methoden: Für alle Versuche wurde eine glomeruläre Endothelzelllinie aus der Maus (glEND.2) verwendet. Um die Funktionen der Rho-Kinasen zu hemmen, wurden unselektive Inhibitoren gegen beide Isoformen, H1152 und Y-27632, verwendet. Ein neuartiger Hemmstoff, der selektiv gegen die Isoform 2 gerichtet ist, SLX2119, wurde verwendet, um Funktionen der Isoform 2 zu untersuchen. Mittels der Western-Blot Technik wurden die Proteinlevel von CTGF, VE-Cadherin, sowie der Phosphorylierungsgrad von MYPT und Cofilin bestimmt. Das Zytoskelett, Zell-Zell-Kontakte und Zell-Matrix-Kontakte wurden immunzytochemisch gefärbt. Zur Bestimmung des Einflusses der ROCK-Inhibitoren auf das Migrationsverhalten der glEND.2-Zellen wurden verschiedene Migrationsassays durchgeführt, der Boyden-Kammer-Assay, der Scratch-Assay und der Barrieren-Assay, sowie ein neuer Migrationsassay, in dem Endothelzellen aus dreidimensionalen Zellsphäroiden auf zweidimensionale Matrices migrierten. Mittels des Matrigel-Assay und des in vitro Sprouting-Assays in Kollagen-Gel wurden Schritte des Angiogeneseprozesses untersucht. Ergebnisse: H1152 führt zur Herabregulation der CTGF-Proteinlevel, während SLX2119 die CTGF-Proteinexpression moduliert, das heißt weder hoch- noch herabreguliert. Sowohl H1152 als auch SLX2119 vermindern ähnlich stark den Phosphorylierungsgrad von MYPT, die Phosphorylierung von Cofilin wird durch H1152 deutlich stärker vermindert als durch SLX2119. Auf Zytoskelettebene führt H1152 nach 24 h zum vollständigen Verlust des zytoplasmatischen F-Aktin sowie zur Ausbildung von Lamellipodien. SLX2119 führt nach 24 h ebenfalls zum Verlust des zytoplasmatischen F-Aktins aber zu einer nukleären Akkumulation von F-Aktin-Fasern, des Weiteren zur Ausbildung von Lamellipodien und einzelner Filopodien. In den zweidimensionalen Trans- und Lateralmigrationsassays konnte weder durch H1152 noch durch SLX2119 eine Beeinflussung der Endothelzellmigration beobachtet werden. Im 3D-2D-Migrationsassay steigert H1152 deutlich die Migration aus dem Sphäroid auf FN, während SLX2119 diese nur leicht steigert. H1152 und Y-27632 führen zu einer verstärkten Strukturbildung auf Matrigel, SLX2119 nur zu einer leichten Steigerung. Im in vitro Sprouting-Assay in Kollagen-Gel vermindern H1152 und SLX2119 in ähnlicher Weise bei Zugabe nach vier Tagen die kumulative Länge der Aussprossungen aus den dreidimensionalen Endothelzellsphäroiden. Des Weiteren führen die ROCK-Inhibitoren zu vermehrtem Auftreten einzeln sitzender Zellen neben den Sphäroiden und zu einer Reorganisation dieser zu gefäßähnlichen Strukturen. Bei Zugabe der Inhibitoren an Tag 1 führte H1152 bei einigen Versuchen zur Verminderung der kumulativen Länge, bei einigen Versuchen änderte der Inhibitor die kumulative Länge der Aussprossungen nicht. Schlussfolgerungen: Für die Regulation der CTGF-Expression in glEND.2 Zellen scheinen beide Rho-Kinase-Isoformen gleichermaßen oder überwiegend die Isoform 1 zuständig zu sein. Als Marker für die Aktivität der Isoform 2 ist der Phosphorylierungsgrad von MYPT besser geeignet als der Phosphorylierungsgrad von Cofilin. Die Hemmung beider ROCK-Isoformen durch H1152 erhöht im 3D-2D-Assay die Zellmotilität durch die Verminderung des zytoplasmatischen F-Aktins und die Verminderung des Zell-Zell-Kontaktmoleküls VE-Cadherin. Dies führt auch zu einer vermehrten Strukturbildung auf Matrigel. Im in vitro Sprouting-Assay ist die Aufrechterhaltung der zytoskelettalen Spannung notwendig für die Stabilisierung bereits gebildeter Aussprossungen, da H1152 und SLX2119 durch Verminderung des Aktinzytoskeletts die Aussprossungen auflösen können.

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