Positionsspezifischer Nachweis und relative Quantifizierung von Modifikationen des alpha-s1-Caseins in Milch mittels MALDI-TOF-MS

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2013-01-23
Issue Year
2012
Authors
Vollmer, Gregor
Editor
Abstract

Milk and dairy products play an important role in human nutrition. Prior to marketing, milk is usually heat-treated in order to ensure microbial stability and to extend shelf life. This thermal treatment, however, can degrade nutrients present in milk, such as carbohydrates, lipids, proteins and vitamins. Severe heat treatment can destroy vitamins and lipids may undergo degradative reactions. It can be expected that thermal treatment leads to protein denaturation, oxidation and crosslinking. Furthermore, reactive dicarbonyls can be formed by degradation of lactose. An important reaction occurring during the heat treatment of milk is the so-called Maillard reaction. This is a reaction between lactose and milk proteins leading to a broad variety of different products. First, the carbonyl group of lactose reacts with either an e-amino moiety of a lysine residue or with the N-terminus of a protein, forming glycosylamine. The latter undergoes Amadori rearrangement leading to the stable Amadori product. With prolonged heat treatment, a multiplicity of advanced products is formed, including carboxymethyllysine (CML) as well as complex, nitrogencontaining, partially brown-coloured structures (melanoidins). These late products are so-called advanced glycation end products (AGEs). The Maillard reaction has a negative impact on the nutrient content of milk and dairy products. This reaction leads to a decrease of the biological value of dietary proteins due to the loss of biologically available lysine, which is an essential amino acid. Hence, industrial heating processes should be optimized in order to minimize the formation of Maillard products and, consequently, the loss of biologically available lysine. Infant formulas are particular dairy products, fulfilling as exactly as possible the nutritional requirements of newborns. Infant formulas are based on cow’s milk, but they are adapted to the composition of human milk by addition of whey proteins and lactose. For safety reasons, infant formulas are severely heat treated. In this case, the loss of the essential amino acid lysine is a serious problem, since newborns cannot compensate a possible deprivation by a balanced diet. The focus of this thesis was the analysis of Maillard- and oxidation products of milk proteins. The aim was to survey the changes of milk proteins as a function of the extent of a heat treatment. as1-Casein is the most abundant protein among all milk proteins. Reactive sites of as1-casein, b-casein, and a-lactalbumin as well as the main types of modifications were identified in a non-targeted approach. In order to determine the modification sites, the proteins of interest were enzymatically partially digested by GluC or AspN. The resulting peptide mixture was analyzed by MALDI-TOF-MS. The modification type was identified by the mass difference between the signals of a native peptide and the same peptide with modification. b-Casein was isolated from UHT-milk using gel electrophoresis, followed by in-geldigestion with GluC and analysis by MALDI-TOF-MS. All expected native peptides were detected, as well as the lactosylation of lys113 and two oxidized methionine residues (met93 and met109). No further modifications were observed using this method; even an additional heat treatment of UHT-milk did not lead to evidence of further modifications. An assay of as1-casein also allowed the detection of only a few modifications. Therefore, a chromatographic separation and fractionation of the peptide mixture obtained by protein digestion were established in order to improve sensitivity. For that purpose, an HPLC-method allowing the separation of the peptides from digested as1-casein was developed; two more methods were established, for the separation of the peptides of digested b-casein and a-lactalbumin, respectively. The peptides were collected in several fractions, freeze-dried, and analyzed by MALDI-TOF-MS. The applied matrix greatly influenced the results and thus, the optimal matrix was identified for every single fraction of the digested as1-casein. a-lactalbumin was analyzed as described above after an incubation with lactose at 60 °C for 14 days in a milk model mixture. After the incubation, the modified protein was digested with AspN and the resulting peptide mixture was separated by HPLC, fractionated, and analyzed by MALDI-TOF-MS. At N-terminus/lys5, lys58/lys62, lys79, lys93/lys94, and lys98/lys108/lys114, Amadori products were detected. However, different lysine residues located in the same peptide after enzymatic hydrolysis cannot be distinguished by this method. These modifications are in good accordance with literature data. At the same positions, except of lys93/lys94, CML was detected; besides, an oxidation of trp60/cys61, met90/cys91, trp104/cys111, and trp118/cys120 was found. as1-casein was incubated with lactose in the milk model system for 14 days at 60 °C. The analysis of the incubated protein revealed several modificated peptides: Amadori products, CML-modifications, and three oxidized side chains (see below for positions). Subsequently, as1-casein isolated from milk samples was assayed. The required separation of the milk proteins was achieved by gel electrophoresis, followed by an in-gel-digestion. Less modifications of as1-casein than in the milk model system were detected; only three oxidized peptides and two Amadori products were found. It was most likely that the elution of the peptides from the gel led to a loss of molecules of interest. Thus, an HPLC-method was established to separate the milk proteins. This procedure did clearly increase the number of detected peptides with modifications. In the following, several milk samples were analyzed with the established method: Raw milk, incubated at 60 °C and 99 °C, a-casein standard protein incubated at 60 °C, and commercially available samples of raw milk, UHT-milk, sterilized milk, and infant formulas. All samples were defatted, as1-casein was isolated by HPLC and digested using GluC. The resulting peptide mixture was fractionated by HPLC and the fractions were measured with MALDI-TOF-MS. The method showed a sequence coverage of 84 %, 13 of the 14 lysine residues were covered, as well as both tryptophan residues and four out of five methionine residues. Identified modifications were singly and doubly oxidized peptides, CML, the Amadori product, and the twofold Amadori product. The latter contains two lactulosyl residues bound to either two lysine residues of one peptide, or to one lysine residue and the N-terminus of the protein. In as1-casein, Amadori products were detected at the positions N-terminus/lys3/lys7, lys34/lys36, lys79/lys83, lys102/lys103/lys105, lys124, lys132, and lys193; CML and the twofold Amadori product at N-terminus/lys3/lys7, lys102/lys103/lys105, and lys79/lys83, respectively. Met123, met135, and met196/trp199 were singly oxidized, Met123 and met196/trp199 also twofold. The oxidative modifications were found in nearly every sample, whereas the Amadori products and CML-modifications were only detected after a specific heating time, depending on the analyzed peptide. For example, CML at lys79/lys83 was not detected until the incubation period reached seven days’ time, the twofold Amadori product was found after an incubation of raw milk at 60 °C for four days. Besides the determination of modification sites and modification types, the collected data allowed a relative quantification of the main modifications. For this purpose, a modification rate was calculated as follows: the signal intensity of a peak induced by a modification was divided by the sum of the signal intensities of the peaks of the native peptide and all its modifications. The modifications of as1-casein isolated from heat treated raw milk (0, 1, 4, 7, and 14 days at 60 °C) were relatively quantified; the resulting modification rates showed different trends, depending on the surveyed modification and peptide. The modification rate of several Amadori products increased during the entire thermal treatment, up to values from 2% (lys34/lys36) to 13% (lys102/lys103/lys105). For different peptides, the modification rate increased, up to 40% on N-terminus/lys3/lys7, and then decreased with prolonged heat treatment. A reason could be the formation of CML, a degradation product of the Amadori product. The corresponding modification rate rose up to values from 0.5% (lys79/lys83) to 7% (N-terminus/lys3/lys7). The twofold Amadori product showed modification rates increasing to 2 %, but it was detected at only two peptides. The modification rates of the oxidation products reached 7% to 33 %, depending on the particular peptide; the ones of the twofold oxidation products up to 3 %. The incubation of raw milk at 99 °C for 0 and 20 minutes, 1, 2, 5, and 10 hours, carried out in triplicate, showed trends very similar to the ones mentioned above. The modification rate of the Amadori products of several peptides increased, up to 9 %, whereas the rate of other peptides showed a maximum at up to 36% after two or five hours of heat treatment, depending on the specific peptide. For CML, modification rates rising to 13% at N-terminus/lys3/lys7 were determined. The values of the twofold Amadori product reached 2 %, whereas this modification could no longer be quantified after ten hours of thermal treatment. The oxidation yielded increasing modification rates up to 61% at met123, the rates of the twofold oxidation reached about 6% at met196/trp199. In the next step, as1-casein from commercially available milk samples was analyzed. The modification rates of the Amadori product increased for all peptides from raw milk via UHT-milk to sterilized milk. The highest modification rate in raw milk was 0.2% at N-terminus/lys3/lys7, in UHT-milk 13 %, and in sterilized milk 24 %. The twofold Amadori product and CML could be quantified in some samples of sterilized milk and only in certain peptides; the values were below 1.5 %. The medians of the modification rates of the oxidation were between 2% and 30 %, depending on sample type and peptide, the ones of the twofold oxidation were below 12 %. The highest modification rate of the Amadori product in as1-casein from infant formulas was 26 %. The twofold Amadori product and CML could once again be quantified only in some peptides deriving from a few products; both showed rates below 1.3 %. These results, as well as the ones for the oxidations, are within the range containing the values of the heated raw milk samples. Hence, the thermal treatment of raw milk samples applied in this study is a valuable model for industrial heat treatment. Some of the analyzed peptides contain more than one possible reaction site; these amino acids cannot be distinguished by MALDI-TOF-MS. The aim of the last part of this work was to determine the positions in a peptide that are actually modified. A tandem mass spectrometer allowing sequencing of peptides was used for this purpose. Heat treated raw milk (two hours at 99 °C) was digested with GluC and the resulting peptide mixture was analyzed by UHPLC-MS/MS. An EPI-Scan (Enhanced Product Ion Scan) was conducted, using multiply charged modified peptides as precursor ions. b- and y-series in the resulting fragment spectra proved that trp199 was doubly oxidized, not the methionine residue in the same peptide. Interestingly, the single oxidation of the same peptide was located at met196, not at trp199. The oxidation of met123 and met135 to methionine sulfoxide and met123 to methionine sulfone have already been detected by MALDI-TOF-MS. In addition to the amino acids mentioned above, an Amadori product at lys58 was detected. MALDI-TOF-MS- and further MS/MSexperiments proved the lactosylation of the N-terminus and lys7, lys34, lys36, lys58, lys79/lys83, lys102, lys105, lys124, lys132, and lys193 in as1-casein. Amadori products, CML, and oxidation products of methionine and tryptophan were identified as the most abundant modifications in as1-casein isolated from thermally treated milk. All modifications were site-specifically relatively quantified. Consequently, the method established here allows to record structure- and site-specific reaction kinetics. These findings can contribute to further optimization of the parameters of an industrial heat treatment.

Abstract

Milch und Milchprodukte spielen eine bedeutende Rolle in der menschlichen Ernährung. Vor der Abgabe an den Verbraucher wird Milch in den allermeisten Fällen hitzebehandelt, um mikrobielle Stabilität sicherzustellen und die Haltbarkeit zu verlängern. Allerdings kann diese Hitzebehandlung die in Milch enthaltenen Nährstoffe, unter anderem Kohlenhydrate, Lipide, Proteine und Vitamine, erheblich schädigen. Vitamine werden durch starke Erhitzung zerstört, bei den Lipiden kann es zu Abbaureaktionen kommen; Proteine können oxidiert werden, denaturieren oder Quervernetzungen ausbilden. Aus dem Milchzucker Lactose können beispielsweise reaktive Dicarbonyle entstehen. Eine wichtige bei der Erhitzung von Milch auftretende Reaktion läuft zwischen der Lactose und den Milchproteinen ab. Diese sogenannte Maillard-Reaktion führt zu einer großen Vielfalt unterschiedlicher Produkte. Das erste stabile Zwischenprodukt, das im Zuge dieser Reaktion gebildet wird, ist das Amadoriprodukt. Dieses entsteht, wenn ein Lactosemolekül an eine e-Aminogruppe eines Lysinrests oder an den N-Terminus eines Proteins gebunden wird. Dauert die Erhitzung länger an, so bilden sich diverse weitere Produkte, von Carboxymethyllysin (CML) bis hin zu komplexen, stickstoffhaltigen und teilweise braun gefärbten Strukturen (Melanoidinen). Diese späten Reaktionsprodukte werden AGEs genannt. Eine weitere Folge der Maillard-Reaktion ist die Abnahme der biologischen Wertigkeit von Nahrungsproteinen, da der Anteil an bioverfügbarem Lysin, einer essentiellen Aminosäure, gesenkt wird. Daher ist es von großer Bedeutung, industrielle Erhitzungsprozesse zu optimieren, um die Bildung von Maillard-Produkten und damit den Lysinverlust zu minimieren. Ein besonderes Milchprodukt ist Kindermilchnahrung, die speziell für die Ernährung von Säuglingen geeignet ist. Diese Produkte basieren auf Kuhmilch, werden jedoch durch Zusatz von unter anderem Molkenproteinen und Lactose an Muttermilch angeglichen. Anschließend werden sie intensiv hitzebehandelt, um die Kleinkinder nicht zu gefährden. Hier wiegt der Verlust an der essentiellen Aminosäure Lysin besonders schwer, da Säuglinge einen möglichen Mangel im Unterschied zu Erwachsenen nicht durch eine ausgewogene Ernährung kompensieren können. Der Fokus dieser Dissertation lag auf dem Nachweis von Maillard-Produkten und oxidativen Veränderungen der Milchproteine. Ziel war, in Abhängigkeit der Intensität einer Erhitzung das Ausmaß der Schädigungen eines Milchproteins zu verfolgen. Untersucht wurde hier as1-Casein, das von allen Milchproteinen am häufigsten vorkommende Protein. Gleichzeitig wurde bestimmt, welche Aminosäurereste von as1-Casein, b-Casein und a-Lactalbumin reaktiv sind und es wurden die Modifikationen identifiziert, die am häufigsten auftreten. Als Nachweistechnik wurde hier MALDI-TOF-Massenspektrometrie eingesetzt. Um die genaue Modifikationsstelle bestimmen zu können, wurden die untersuchten Proteine im Vorfeld enzymatisch durch Endoproteasen partiell verdaut. Für die Caseine hat sich herausgestellt, dass die Endoprotease GluC das am besten geeignete Verdauenzym ist. Die Identifikation des Modifikationstyps erfolgte über die Massendifferenz zwischen den Signalen eines nativen Peptids und des gleichen Peptids mit Modifikation. b-Casein wurde gelelektrophoretisch aus UHT-Milch isoliert, im Gel mit GluC verdaut und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Es konnten alle erwarteten nativen Peptide detektiert werden, ebenso wie die Lactosylierung von Lys113 und zwei Oxidationen von Methionin zu Methioninsulfoxid (Met93 und Met109). Unter Anwendung dieser Methode konnten keine weiteren Modifikationen nachgewiesen werden; auch eine zusätzliche Hitzebehandlung der UHT-Milch vor der Untersuchung führte nicht zum Nachweis weiterer Modifikationen. Ebenso konnten bei der Untersuchung von as1-Casein nur einige wenige Modifikationen detektiert werden. Deshalb wurde durch eine chromatografische Auftrennung und Fraktionierung der beim Verdau erhaltenen Peptidmischung die Empfindlichkeit verbessert. Dazu wurde eine HPLC-Methode etabliert, die die Trennung der Peptide aus dem Hydrolysat von as1-Casein ermöglicht; ebenso wurde je eine weitere Methode für die Auftrennung der Peptide aus den Hydrolysaten von b-Casein und a-Lactalbumin entwickelt. Die Peptide wurden in mehreren Fraktionen aufgefangen, gefriergetrocknet und anschließend mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Dabei zeigte sich ein relativ großer Einfluss der verwendeten Matrix, weshalb für jede as1-Casein-Fraktion individuell die optimal geeignete Matrix identifiziert und im Folgenden eingesetzt wurde. Auf diese Weise wurde zunächst das Milchprotein a-Lactalbumin untersucht, nachdem es in einem Milchmodellsystem mit Lactose inkubiert worden war. Nach Erhitzung des Proteins für 14 Tage bei 60 °C mit Lactose in milchtypischen Konzentrationen wurde es mit AspN verdaut, die Peptidmischung chromatografisch aufgetrennt, fraktioniert und mittels MALDI-TOF-MS vermessen. So konnten Amadoriprodukte an N-Terminus/Lys5, Lys58/Lys62, Lys79, Lys93/Lys94 und Lys98/Lys108/Lys114 nachgewiesen werden. Allerdings können mit dieser Methode einzelne Lysinreste, die nach der enzymatischen Hydrolyse im gleichen Peptid lokalisiert sind, nicht unterschieden werden. Die Modifikationen stehen in guter Übereinstimmung mit Literaturdaten. An den gleichen Positionen (außer Lys93/Lys94) konnten CML-Modifikationen nachgewiesen werden, des Weiteren wurden die Oxidationen von Trp60/Cys61, Met90/Cys91, Trp104/Cys111 und Trp118/Cys120 detektiert. Ebenso wurde im Milchmodellsystem mit Lactose für 14 Tage bei 60 °C erhitztes as1-Casein untersucht; es konnten an jeweils mehreren Peptiden das Amadoriprodukt und CML nachgewiesen werden, zusätzlich drei oxidierte Peptide (Positionen siehe unten). Im Anschluss sollte aus Milchproben isoliertes as1-Casein vermessen werden. Zuerst wurde die erforderliche Trennung der Milchproteine durch Gelelektrophorese realisiert, gefolgt von einem In-Gel-Verdau. Wie sich allerdings zeigte, konnten auf diese Weise deutlich weniger Modifikationen des as1-Caseins nachgewiesen werden als bei der Erhitzung im Milchmodellsystem; im Einzelnen die drei oxidierten Peptide und zwei Lactosylierungen. Daher wurde eine Trennung der Milchproteine mittels HPLC etabliert. Durch diese Verbesserung konnte die Anzahl der erfassten modifizierten Peptide deutlich erhöht werden, was möglicherweise dadurch erklärt werden kann, dass die Elution der Peptide aus dem Gel zu größeren Verlusten geführt hat. Mit dieser hier etablierten Methode wurden anschließend diverse Milchproben vermessen: Bei 60 °C und bei 99 °C hitzeinkubierte Rohmilch, bei 60 °C inkubierter a-Casein-Standard sowie Handelsproben von Rohmilch, UHT-Milch, Sterilmilch und Kindermilchnahrungen. Alle Proben wurden zuerst entfettet, dann wurde mittels HPLC as1-Casein isoliert und dieses mit GluC verdaut. Die resultierende Peptidmischung wurde an der HPLC fraktioniert und die einzelnen Fraktionen wurden mittels MALDI-TOF-MS vermessen. Diese Methode ergab eine Sequenzabdeckung von 84% bei as1-Casein; es wurden 13 der 14 vorhandenen Lysinreste abgedeckt, ebenso beide Tryptophanreste und vier der fünf Methioninreste. An Modifikationen konnten einfach und zweifach oxidierte Peptide, CML und das einfache und zweifache Amadoriprodukt nachgewiesen werden; bei letzterem ist je ein Lactulosylrest an zwei Lysinreste eines Peptids (oder an einen Lysinrest und den N-Terminus des Proteins) gebunden. In as1-Casein wurden Amadoriprodukte an den Positionen N-Terminus/Lys3/Lys7, Lys34/Lys36, Lys79/Lys83, Lys102/Lys103/Lys105, Lys124, Lys132 und Lys193 nachgewiesen, das zweifache Amadoriprodukt und CML jeweils an N-Terminus/Lys3/Lys7, Lys102/Lys103/Lys105 und Lys79/Lys83. Einfache Oxidation zeigten Met123, Met135 und Met196/Trp199, zweifache Oxidation nur Met123 und Met196/Trp199. Während die Oxidationsprodukte in fast allen Proben detektiert wurden, waren die Amadoriprodukte sowie die CML-Modifikationen abhängig vom Peptid erst nach einer bestimmten Erhitzungszeit nachweisbar. Beispielsweise wurde CML an Lys79/Lys83 erst nach Inkubation von Rohmilch für sieben Tage bei 60 °C nachweisbar, das zweifache Amadoriprodukt bereits nach Inkubation für vier Tage. Die Messdaten ermöglichten neben dem qualitativen Nachweis von Modifikationen auch die relative Quantifizierung der Hauptmodifikationen des as1-Caseins. Die dabei eingesetzte Modifikationsrate wurde folgendermaßen errechnet: Die Signalintensität des Peaks einer Modifikation wurde geteilt durch die Summe der Signalintensitäten der Peaks des nativen Peptids und aller zugehöriger Modifikationen. Bei der relativen Quantifizierung der Modifikationen des as1-Caseins aus bei 60 °C für 0, 1, 4, 7 und 14 Tage erhitzter Rohmilch ergaben sich je nach Peptid und Modifikation sehr unterschiedliche Verläufe der einzelnen Modifikationsraten. Bei einigen Peptiden nahm die Modifikationsrate des Amadoriprodukts während der gesamten Erhitzung zu, bis auf Werte von etwa 2% an Lys34/Lys36 und bis 13% an Lys102/Lys103/Lys105. Bei anderen Peptiden nahm sie erst zu, bis auf 40% an N-Terminus/Lys3/Lys7, und anschließend bei weiter andauernder Erhitzung wieder ab. Ein Grund dafür könnte die Bildung von CML, einem Abbauprodukt des Amadoriprodukts, sein; hier ergab sich bei allen modifizierten Peptiden ein Anstieg der Modifikationsrate, auf 0,5% an Lys79/Lys83 bis zu 7% an N-Terminus/Lys3/Lys7. Das zweifache Amadoriprodukt zeigte auf etwa 2% ansteigende Modifikationsraten, konnte aber nur an zwei Peptiden relativ quantifiziert werden. Die Modifikationsraten der einfachen Oxidation erreichten peptidabhängig 7% bis 33 %, die der zweifachen Oxidation bis zu 3 %. Die Erhitzung von Rohmilch bei 99 °C für 0 und 20 Minuten sowie 1, 2, 5 und 10 Stunden wurde in unabhängiger Dreifachbestimmung durchgeführt. Es ergaben sich Kurvenverläufe, die den oben genannten sehr ähnlich waren. Während auch hier die Modifikationsrate des Amadoriprodukts mancher Peptide anstieg (auf Werte bis zu 9 %), zeigte sie bei anderen Peptiden ein Maximum von bis zu 36% nach zwei bzw. fünf Stunden Erhitzung, abhängig vom jeweiligen Peptid. Für CML wurden auf bis zu 13% (an N-Terminus/Lys3/Lys7) zunehmende Modifikationsraten bestimmt. Die Werte des zweifachen Amadoriprodukts lagen wiederum bei maximal etwa 2 %, jedoch war diese Modifikation nach 10 Stunden Erhitzung nicht mehr quantifizierbar. Die einfache Oxidation ergab steigende Modifikationsraten auf bis zu etwa 61% an Met123, die Modifikationsrate der zweifachen Oxidation erreichte etwa 6% an Met196/Trp199. Anschließend wurde as1-Casein aus Handelsproben untersucht. Die Modifikationsraten des Amadoriprodukts stiegen bei allen Peptiden von Rohmilch über UHT-Milch bis zur Sterilmilch an. In Rohmilch betrug die maximale Modifikationsrate 0,2% an N-Terminus/Lys3/Lys7, bei UHT-Milch 13 %, in Sterilmilch 24 %. Das zweifache Amadoriprodukt und CML konnten nur in manchen Sterilmilchproben an einzelnen Peptiden relativ quantifiziert werden, die Gehalte lagen unter 1,5 %. Die Mediane der Modifikationsraten der einfachen Oxidation lagen proben- und peptidabhängig zwischen 2% und 30 %, die der zweifachen Oxidation unter 12 %. Bei den Kindermilchnahrungen wies das Amadoriprodukt Modifikationsraten bis zu 26% auf. Auch hier ergaben das zweifache Amadoriprodukt und CML nur in manchen Proben und an einzelnen Peptiden quantifizierbare Werte; diese lagen unterhalb von 1,3 %. Diese Ergebnisse liegen ebenso wie die der einfachen und zweifachen Oxidation in dem Bereich, in dem die Werte der erhitzten Rohmilchproben liegen. Das zeigt, dass die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Erhitzungsserien von Rohmilch ein gutes Modell für die industrielle Erhitzung darstellen. Einige der untersuchten Peptide enthalten mehrere mögliche Modifikationsstellen, deren Unterscheidung durch Vermessung mittels MALDI-TOF-MS nicht möglich ist. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, welche dieser Positionen tatsächlich modifiziert sind. Dazu wurde ein Tandem-Massenspektrometer eingesetzt, das eine Sequenzierung von Peptiden erlaubt. Es wurde für 2 Stunden bei 99 °C hitzebehandelte Rohmilch mit GluC verdaut und die Peptidmischung mittels UHPLC-MS/MS vermessen. Es wurde ein EPI-Scan (Enhanced Product Ion Scan) durchgeführt, wobei als Vorläuferionen mehrfach geladene modifizierte Peptide ausgewählt wurden. Anhand von b- und y-Serien in den resultierenden Fragmentspektren konnte gezeigt werden, dass in dem Peptid, das Met196 und Trp199 enthält, nur der Tryptophanrest zweifach oxidiert vorliegt, die einfache Oxidation jedoch am Methioninrest lokalisiert ist. Bereits gezeigt wurden die Methioninoxidationen von Met123 und Met135 zum Methioninsulfoxid und von Met123 zum Methioninsulfon. Zusätzlich zu den oben genannten Aminosäuren konnte ein Amadoriprodukt an Lys58 nachgewiesen werden. Anhand weiterer Untersuchungen konnte abschließend die Lactosylierung des N-Terminus und von Lys7, Lys34, Lys36, Lys58, Lys79/Lys83, Lys102, Lys105, Lys124, Lys132 und Lys193 in as1-Casein nachgewiesen werden. Als wichtigste Modifikationen des as1-Caseins in thermisch behandelter Milch wurden das Amadoriprodukt, CML sowie Oxidationsprodukte von Methionin und Tryptophan identifiziert. Alle Modifikationen wurden positionsspezifisch relativ quantifiziert. Damit erlaubt die Methode, struktur- und positionsspezifische Reaktionskinetiken zu erstellen. Solche Erkenntnisse können dazu beitragen, Parameter einer industriellen Erhitzung weiter zu optimieren.

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