Untersuchungen zu Expressionsregulation und molekularem Wirkmechanismus des Transkriptionsfaktors Sox10 in Gliazellen der Maus

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-10-02
Issue Year
2012
Authors
Küspert, Melanie
Editor
Abstract

In vertebrates the transcription factor Sox10 plays essential roles during development of glial cell types of the central (CNS) and peripheral nervous systems (PNS). Until now the regulation of its own gene expression remains largely unknown. The same holds for the regulatory mechanisms it uses to control expression of its target genes. In this thesis the control of oligodendroglial Sox10 expression was studied by analysis of the Sox10 enhancer U2. Sox10 expression in oligodendrocyte precursor cells was shown to be activated by the bHLH transcription factor Olig2. Olig2 binds in vitro and in vivo to the U2 enhancer and is able to activate it on its own or synergistically with the bHLH factor E47. In cell culture and in transgenic mice, one out of three identified bHLH binding sites turned out to be essential for U2 activation. Additionally the transcription factor Nkx6.2 acted as a negative regulator of U2 activity and was shown to interact with Olig2 and repress its activating effect. The second part of this thesis addressed the mechanisms of Sox10-dependent target gene regulation in Schwann cells by analyzing the Dhh gene. By means of comparative genomic studies and reporter gene analyses a conserved region with Schwann-cell-specific enhancer activity was identified within intron I of the murine Dhh gene. Within this enhancer three monomeric Sox binding sites were mapped, which all showed binding by Sox10 in gel retardation and Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays. In vitro and in vivo analyses of enhancer variants that harbored binding site mutations clearly showed that these sites were functional and essential for activation of the Dhh enhancer by Sox10. Additionally the Schwann-cell-specific enhancer activity was shown to dependent on Sox10 in vivo. Dhh, an extracellular signaling molecule secreted by Schwann cells, exerts an essential role during nerve sheath formation. By illustrating the influence of Sox10 on Dhh expression this study provides a mechanistic explanation for the non-cell-autonomous function of Sox10 in nerve sheath formation. The molecular mechanism of Sox10 function was further elucidated in the third part of this thesis by investigating two additional Schwann-cell-specific, Sox10-dependent enhancers. Using a combination of ChIP and shRNA treatment in cultivated cells or a combination of ChIP and Cre-mediated gene deletion in murine peripheral nerve tissue, Sox10 was shown to recruit Brg1, the core subunit of the BAF chromatin-remodeling complex, to these enhancers at the time of Schwann cell differentiation. Therefore Sox10 appears to exert its gene regulatory function at least partially by recruitment of chromatin-remodeling factors thereby enhancing the accessibility of Sox10-regulated genes for transcription.

Abstract

Der Transkriptionsfaktor Sox10 ist für die Entwicklung vieler glialer Zelltypen des zentralen (ZNS) und peripheren Nervensystems (PNS) in Wirbeltieren essentiell. Die Kontrolle seiner Genexpression sowie die Regulationsmechanismen seiner Zielgene sind bisher weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit wurde die Kontrolle der oligodendrozytären Sox10-Expression durch Analyse des Sox10-Enhancers U2 untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass die Sox10-Expression in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch den bHLH-Transkriptionsfaktor Olig2 aktiviert wird. Dabei bindet Olig2 in vitro und in vivo an den U2-Enhancer und kann diesen allein und synergistisch mit dem bHLH-Faktor E47 aktivieren. Eine von drei in vitro identifizierten Bindestellen erwies sich in Zellkultur und im transgenen Maus-Modell als essentiell für die U2-Aktivierung. Als negativer Regulator wirkte der Transkriptionsfaktor Nkx6.2, der mit Olig2 interagiert und dessen Wirkung reprimiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Mechanismen der Sox10-abhängigen Zielgen-Regulierung in Schwann-Zellen am Beispiel des Dhh-Gens untersucht. Mittels vergleichender Genom- und Reportergen-Analysen wurde im Intron I des murinen Dhh-Gens eine konservierte Region mit Schwann-Zell-spezifischer Enhancer-Funktion identifiziert. Innerhalb dieses Enhancers liegen drei monomere Sox-Bindestellen, deren Bindung durch Sox10 in Gelretardierungsexperimenten und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) aufgezeigt wurde. In Mutations-Analysen erwiesen sich diese Bindungen in vitro und in vivo als funktional und essentiell für die Sox10-Aktivierung des Dhh-Enhancers. Außerdem wurde in vivo die Abhängigkeit der Schwann-Zell-spezifischen Aktivität dieses Enhancers von Sox10 nachgewiesen. Da Dhh ein extrazelluläres, von Schwann-Zellen sezerniertes Signalmolekül darstellt, das für die Entwicklung der Nervenscheide essentiell ist, wurde in dieser Arbeit der Mechanismus aufgezeigt, wie Sox10 die Bildung der Nervenscheide auf nicht-zellautonomen Weg beeinflusst. An zwei weiteren Schwann-Zell-spezifischen Enhancern, die durch Sox10 reguliert werden, konnte im dritten Teil der Arbeit der molekulare Wirkmechanismus von Sox10 näher bestimmt werden. Es ließ sich nachweisen, dass Sox10 Brg1, die zentrale Komponente des BAF-Chromatin-Remodeling-Komplexes, an diese Enhancer rekrutiert. Der Nachweis wurde durch Kombination von ChIP mit shRNA-Behandlung beziehungsweise Cre-abhängiger Gendeletion in kultivierten Zellen und in peripheren Nerven der Maus zum Zeitpunkt der Schwann-Zell-Differenzierung erbracht. Sox10 scheint somit seine genregulatorische Funktion zumindest teilweise durch die Rekrutierung Chromatin-remodellierender Faktoren auszuüben und so die von ihm regulierten Gene für die Transkriptionsmaschinerie zugänglich zu machen.

DOI
Document's Licence
Faculties & Collections
Zugehörige ORCIDs