Genregulation in Bacillus subtilis durch neuartige integrative Elemente und Tet Repressor Varianten

Gene regulation in Bacillus subtilis by novel integrative elements and Tet repressor variants

Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus-2906
  • TetR-basierte Transkriptionskontrolle ist eine in zahlreichen Organismen angewandte Methode zur konditionalen Genexpression. Der Anwendungsbereich des tet-Systems wurde durch Veränderungen des Regulators und dessen Liganden erweitert, indem TetR Varianten mit veränderter Induktor- oder Operatorerkennung generiert wurden (TetRi, TetRo), sowie Mutanten die eine Umkehrung der Aktivität aufweisen (TetRr). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob die beiden phänotypischen Aberationen einer veränderten Induktorspezifität und eines reversen Verhaltens innerhalb neu zu generierender TetRri Varianten funktionell vereint werden können. Hierzu wurden die MutationenTetR-basierte Transkriptionskontrolle ist eine in zahlreichen Organismen angewandte Methode zur konditionalen Genexpression. Der Anwendungsbereich des tet-Systems wurde durch Veränderungen des Regulators und dessen Liganden erweitert, indem TetR Varianten mit veränderter Induktor- oder Operatorerkennung generiert wurden (TetRi, TetRo), sowie Mutanten die eine Umkehrung der Aktivität aufweisen (TetRr). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob die beiden phänotypischen Aberationen einer veränderten Induktorspezifität und eines reversen Verhaltens innerhalb neu zu generierender TetRri Varianten funktionell vereint werden können. Hierzu wurden die Mutationen zwölf reverser TetR Varianten mit denen von TetRi1 (H64K S135L) kombiniert, welcher eine relaxierte Spezifität für das semisynthetische Tetrazyklinderivat 4-ddma-atc aufweist. Vier der kombinierten Regulatoren zeigten deutliche 4-ddma-atc vermittelte Korepression in vivo. Bei der Implementierung von sieben TetRr Mutationen in die exklusiv mit 4-ddma-atc induzierbare Variante TetRi2 (H64K S135L S138I), zeigte zunächst lediglich ein Vertreter moderate in vivo Korepression mit diesem Derivat. Jedoch wurde mit TetRri10 eine Variante mit einem deutlich ausgeprägten „ri“ Phänotyp konstruiert. Hierbei wurde festgestellt, dass die Mutation V99G zwar in Verbindung mit in TetRi2 reversen Phänotyp vermittelt, TetR V99G alleine jedoch nicht revers ist. Im Rahmen einer Mutationsanalyse wurde die Mutantenkombination H64K V99G S138I als ursächlich für den beobachteten Phänotyp von TetRri10 identifiziert. In einem zweiten Projekt wurden DNA Elemente entwickelt, mittels derer tet-regulierbare Auswärts-Promotoren Zielstellen-unspezifisch in das Genom von Bacillus subtilis eingebracht werden können. Der Grundaufbau dieser InsTetG+ genannten Elemente beinhaltet stromaufwärtige Translations- und Transkriptionsterminatoren, einen Kanamycin-Selektionsmarker, sowie einen divergent dazu angeordneten atc-sensitiven Pxyl/tet Promotor. Die Elemente InsTetG+1 und InsTetG+1a tragen den Regulator in cis codiert, so dass Ein-Schritt-Mutagenesen möglich sind. Da mit diesen Elementen lediglich moderate Regulationsfaktoren erreicht werden konnten, wurde InsTetG+2 konstruiert, welches kein tetR Gen trägt; stattdessen wird der Regulator episomal codiert. Dies resultierte sowohl mit wt-TetR als auch mit TetRr2 in effizienter Regulation. Zur Mobilisierung der InsTetG+-Sequenzen dienten flankierende „Mosaik Elemente“, welche Bindestellen für Tn5-Transposase darstellen. So war es möglich, in vitro assemblierte Transposomen, ternäre Transposase2-InsTetG+-Komplexe, durch Elektroporation in B. subtilis einzubringen. Im Rahmen einer Mutagenese von B. subtilis mit InsTetG+1 Transposomen wurden 387 Kandidaten erhalten und analysiert. Zwei Stämme wiesen atc-abhängige Auxotrophie auf, ein weiterer war regulierbar wuchsdefekt. Ein Ansatz einer InsTetG+2-Transposom-Mutagenese von B. subtilis/pWH119 lieferte etwa 1200 kanamycinresistente Kandidaten. Unter 432 analysierten Stämmen zeigten sechs regulierbare Wuchsdefizienz, während ein weiterer konditionale Auxotrophie aufwies. Da tetR in pWH119 einer PxylA Transkription unterliegt, war ein zusätzlicher Regulationsmodus möglich. So führte Xylose-Zugabe zu einer erhöhten TetR Expression, wodurch eine dichtere, jedoch voll atc-regulierbare Repression ermöglicht wurde. Mit hprK als Zielgen wurde demonstriert, dass InsTetG+ Elemente durch entsprechende Flankierung mit homologen Sequenzen auch ortsspezifisch in das B. subtilis Genom integrierbar sind. Bei drei verschieden regulierbaren hprK Stämmen konnte die Expression der codierten HPr- Kinase/Phosphorylase atc-abhängig moduliert werden.show moreshow less
  • TetR-based transcriptional control is a well established tool for conditional gene-expression in a wide variety of organisms. The field of application has been broadened through variations of the regulator and its ligands. Several TetR variants recognizing altered inducers (TetRi) or operators (TetRo) were created, as well as mutants that exhibit a reversal of activity (TetRr). In the first part of this work, the issue was addressed, whether the phenotypic alterations of shifted inducer-specificity and reversed activity can functionally be combined in novel TetR proteins. Therefore, twelve TetRr variants’ mutations were combined with those of TetRi1 (H64K S135L), which exhibits relaxedTetR-based transcriptional control is a well established tool for conditional gene-expression in a wide variety of organisms. The field of application has been broadened through variations of the regulator and its ligands. Several TetR variants recognizing altered inducers (TetRi) or operators (TetRo) were created, as well as mutants that exhibit a reversal of activity (TetRr). In the first part of this work, the issue was addressed, whether the phenotypic alterations of shifted inducer-specificity and reversed activity can functionally be combined in novel TetR proteins. Therefore, twelve TetRr variants’ mutations were combined with those of TetRi1 (H64K S135L), which exhibits relaxed specificity for the semi-synthetic tetracycline-derivative 4-ddma-atc. Four of the combined regulators displayed pronounced 4-ddma-atc mediated co-repression in vivo. Upon implementation of seven TetRr’s mutations into TetRi2, which is exclusively induced by 4-ddma-atc, only one candidate showed moderate co-repression in vivo with this derivative. However, with TetRri10 one other variant was constructed that exhibits a pronounced “ri” phenotype. It was discovered that V99G elicits a reverse phenotype in conjunction with TetRi2-mutations, but not alone. A mutational analysis revealed that the combination H64K V99G S138I is critical for the obtained phenotype of TetRri10. In the second project, DNA elements harboring tet-regulatable outward-promoters for random integration into the genome of Bacillus subtilis were constructed. The basic architecture of these InsTetG+ termed elements consists of upstream translational and transcriptional terminators, a kanamycin-resistance cassette for selection and a divergent atc-sensitive Pxyl/tet promoter. Elements InsTetG+1 and 1a are vested with a tetR-gene in cis, allowing for one-step mutagenesis. Since only moderate regulatory windows are achieved using these elements, tetR was eliminated, giving rise to InsTetG+2. Efficient regulation was accomplished through episomal expression of either wt-tetR or tetRr2. Mobilization of the elements was brought about by “mosaic elements”, comprising binding sites for Tn5-transposase. Thereby, it was possible to transfer in vitro assembled InsTetG+-DNA-Transposase2-complexes (transposomes), into B. subtilis via electroporation. One mutagenesis set-up using InsTetG+1 transposomes yielded 387 candidates, which were analyzed. Two strains exhibited atc-dependent auxotrophy, while another one was conditionally deficient in growth. InsTetG+2 transposome-mutagenesis resulted in ~1200 kanamycin-resistant strains in one set-up. Among 432 analyzed strains six were regulatable growth-deficient, whereas one displayed conditional auxotrophy. As tetR expression in pWH119 is under transcriptional control by xylose, an additional regulation mode could be exploited. Application of xylose resulted in an enhanced TetR expression, leading to tighter repression, however still permitting complete induction by atc. Using hprK as a target-gene, the suitability of InsTetG+ elements for site specific integration into the B. subtilis genome was proven, when flanked by appropriate homologous sequences. In three differently regulatable hprK strains, the expression of the encoded HPr-kinase/phoshorylase could be modulated by atc.show moreshow less

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Metadaten
Author:Ralph Bertram
URN:urn:nbn:de:bvb:29-opus-2906
Advisor:Wolfgang Hillen
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2005
Publishing Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Granting Institution:Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2005/12/09
Release Date:2005/12/21
Tag:Tn5
Tn5
SWD-Keyword:Bacillus; Genregulation; Tetracycline; Transposon
Institutes:Naturwissenschaftliche Fakultät / Naturwissenschaftliche Fakultät -ohne weitere Spezifikation-
Dewey Decimal Classification:Naturwissenschaften und Mathematik / Biowissenschaften; Biologie / Biowissenschaften; Biologie
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