TIP-vermittelte Induktion Tetrazyklin-abhängiger Transregulatoren in Saccharomyces cerevisiae und HeLa Zellen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-03-05
Issue Year
2012
Authors
Stöckle, Christoph
Editor
Abstract

Due to Tet-repressor’s (TetR) high affinity and specificity for its corresponding operator sequence and its inducers, it has been used in a wide variety of regulatory systems for inducible gene control in both procaryotes and eucaryotes. Although the variety of possible applications was further expanded by the discovery of TetR inducing peptides (TIPs), their application has so far been limited to prokaryotic organisms. Therefore, one project of this thesis dealt with modifying a reporter system for Saccharomyces cerevisiae which had already been successfully used to show induction of a TetR double-mutant (N82A/F86A) based tetracycline-dependent transsilencer by the peptide W-TIP. The aim of this project was to show TIP-mediated induction of a corresponding tTS variant based on wildtype (wt) TetR, the most frequently used TetR variant in gene regulation systems for eucaryotes. Starting from mCherry, seven versions of the TIP scaffold protein differing in nuclear localization sequence (NLS), linker-sequence between NLS and mCherry as well as codon usage were compared to determine the optimal variant. Nuclear accumulation, high expression and little influence on the growth of the model organism were the selection criteria. The combination with the best overall properties contained an N-terminal SV40 NLS with a 10 residue linker and a mCherry gene adapted to yeast codon usage. Combining this scaffold protein with the inducer-peptide TIP2 finally allowed to show dose-dependent induction of a wt TetR-based tTS variant, demonstrating for the first time induction of a wt-based tetracycline-dependent transregulator in an eucaryotic organism. The second project dealt with the construction of reporter cell lines for analyzing nucleo-cytoplasmic transport of TIP-fused protein which carry all reporter system components stably integrated into the host genome. Transcription of a luciferase reporter gene was regulated by a tetracycline-dependent transactivator (tTA). Because the tTA variant is only induced if the constitutively expressed TIP-fusion localizes to the cell’s nucleus, lucifease expression serves as an indirect indicator of the TIP-fusion protein’s subcellular localization. For the application of the reporter system three proteins from the influenza A virus were tested for their suitability and finally the nucleoprotein (NP) was selected. In a pilot experiment, dose-dependent induction of tTA by the TIP2-fusion protein NP-TIP2 was successfully shown in Escherichia coli. In the next step, the reporter cell’s functionality was tested by reducing the NP-TIP2 nuclear concentration. This should be accomplished on the one side by nucleozin, a specific inhibitor for the nuclear import of NP and on the other side through reduction of NP-TIP2 expression by RNA-interference. Nucleozin neither lead to a change in luciferase expression in the reporter cells, nor to inhibition of nuclear import of a fusion protein consisting of NP and the green fluorescent protein EGFP. In the RNA-interference approach, the reporter cell lines were transfected with specific siRNA, a non-specific siRNA served as control. The increased luciferase activity observed with the specific siRNA is a clear hint for the functionality of the reporter cell line.

Abstract

Aufgrund der hohen Affinität und Spezifität gegenüber Operatorsequenz und Induktor wurde der Tetrazyklin-Repressor (TetR) in verschiedensten Systemen für die konditionale Genregulation sowohl in Prokaryonten, als auch in Eukaryonten eingesetzt. Obwohl das Spektrum von möglichen Applikationen durch die Entdeckung der TetR induzierenden Peptide (TIPs) noch erweitert wurde, war deren Anwendung bisher auf prokaryontische Organismen limitiert. Ein Teilprojekt dieser Arbeit befasste sich mit der Modifikation eines bestehenden Reportersystems für Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Mit diesem System konnte bereits die Induktion eines auf der TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierenden Tetrazyklin-abhängigen „Transsilencers“ (tTS) durch das Peptid W-TIP gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es die TIP-vermittelte Regulation einer tTS Variante zu zeigen, die auf TetR(B) Wildtyp (wt), einer der in eukaryontischen Transregulatoren am häufigsten verwendeten TetR Varianten, basierte. Hierzu wurden ausgehend von mCherry verschiedene Trägerproteinvarianten für das Induktorpeptid konstruiert, die sich in der verwendeten Kernlokalisationssequenz, der Linkersequenz zwischen NLS und mCherry sowie deren Codongebrauch unterschieden. Das Trägerprotein sollte im Zellkern lokalisiert sein, eine hohes Expressionsniveau aufweisen und einen möglichst geringen Einfluss auf das Wachstum des Modellorganismus haben. Die Proteinvariante mit der besten Kombination dieser Eigenschaften enthielt eine N-terminale SV40 NLS mit einer 10 AS langen „Linkersequenz“ und wurde durch ein an S. cerevisiae adaptiertes mcherry Gen codiert. Mit einer Fusion dieses Trägerproteins mit dem Induktorpeptid TIP2 konnte schließlich die konzentrationsabhängige Induktion einer auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante gezeigt werden. Dies stellte den ersten Nachweis TIP-vermittelter Genregulation eines auf TetR(B) wt basierenden Transregulators in einem eukaryontischen Organismus dar. Ein weiteres Teilprojekt der Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung von Reporterzelllinien zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports von TIP-Fusions-proteinen. Die Expression aller Komponenten des Reportersystems in den Reporterzelllinien erfolgte hierbei über unabhängige, stabile Integrationen. Als Reporter diente die Luciferase aus Photinus pyralis, deren Transkription über einen, auf TetR(B) wt basierenden, Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (tTA) reguliert wurde. Da eine Induktion der tTA Variante durch das konstitutiv exprimierte TIP-Fusionsprotein nur dann erfolgen konnte, wenn sich das TIP-Fusionsprotein im Zellkern befand, wurde die Expression der Luciferase zum indirekten Indikator für dessen subzelluläre Lokalisation. Für die Anwendung des Reportersystems wurden drei Proteine aus dem Influenza A Virus auf ihre Eignung hin überprüft und unter diesen letztlich das Nucleoprotein (NP) ausgewählt. Die Konzentrations-abhängige Induktion von TetR(B) wt durch eine Fusion bestehend aus NP und TIP2 (NP-TIP2) konnte erfolgreich in Escherichia coli gezeigt werden. Die Überprüfung der Funktionalität der Reporterzelllinien sollte im nächsten Schritt durch eine Reduktion der nukleären Konzentration von NP-TIP2 erfolgen. Dies sollte zum Einen durch Blockierung des NP Kernimports mittels des spezifischen Inhibitors Nucleozin und zum Anderen durch Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz erreicht werden. Mittels Nucleozin konnte allerdings weder eine Modulation der Luciferaseexpression der Reporterzelllinien, noch eine Inhibierung des Kernimports einer Fusion bestehend aus NP und dem fluoreszierenden Protein EGFP beobachtet werden. Für die Validierung der Reporter-zelllinien über RNA-Interferenz wurden die Reporterzelllinien und deren Ausgangszelllinie mit spezifischer siRNA für NP-TIP2 bzw. einer unspezifischen Kontroll-RNA transfiziert. Mit diesem Ansatz konnte ein eindeutiger Hinweis auf die Funktionalität der Reporterzelllinien erbracht werden.

DOI
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