Neue Perspektive in der Therapie der Alzheimerschen Demenz – Identifizierung und Charakterisierung von Peptiden als Tau-Aggregationsinhibitoren

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2022-08-08
Issue Year
2022
Authors
Aillaud, Isabelle
Editor
Abstract

Currently, about 55 million people worldwide suffer from dementia. Alzheimer's dementia (AD) is the most common cause of dementia, accounting for an estimated 60 % to 80 % of cases. AD is a progressive neurodegenerative disorder that mainly affects older adults. The neurological changes of AD are thought to begin years or decades before symptoms appear. It begins with changes in the brain that are initially unnoticed by those affected. Only after years of brain changes do noticeable symptoms such as memory loss and speech problems occur. The symptoms occur because nerve cells in parts of the brain responsible for perception, learning and memory (cognitive functions) have been damaged or destroyed. As the disease progresses, the pathology spreads to other parts of the brain until eventually people are no longer able to perform basic bodily functions such as walking and swallow. In the final stages of the disease, sufferers become bedridden and require round-the-clock care. The main pathologies of AD are the accumulation of the protein fragment beta-amyloid (so-called Aβ plaques) outside the nerve cells in the brain and deposits of the Tau protein (so-called Tau tangles) inside the nerve cells. These changes are accompanied by the death of nerve cells and damage to brain tissue, which in turn lead to inflammation and a decrease in brain volume (atrophy). A definite diagnosis can currently only be made after death and none of the currently available drugs for AD slow or stop the damage and destruction of nerve cells, so only symptomatic treatment is available. Many potential therapeutic agents for AD related to Aβ pathology have been successfully tested in preclinical models, but most of them failed in clinical trials due to lack of therapeutic benefit or undesirable side effects. The US Food and Drug Administration (FDA) has approved aducanumab, an Aβ antibody, as the only drug that can potentially slow the progression of AD, yet the approval is controversial and the efficacy of aducanumab needs to be proven in further studies. Aducanumab was not approved by the European Medicines Agency (EMA) due to unproven efficacy and possible serious side effects. Numerous studies suggest that Tau pathology is more closely related to disease progression and clinical symptoms, which has led to increased research into Tau-associated agents. Tau pathology occurs not only in AD, but also in other neurological diseases called tauopathies, which could expand the scope of a therapeutic agent. Tau is an intracellularly expressed protein involved in microtubule stabilisation and axonal transport. Under pathological conditions, Tau detaches from microtubules, causing them to disintegrate and the unbound Tau may aggregate into oligomers or paired helical filaments (PHFs). The two hexapeptide sequences PHF6 (VQIVYK) and PHF6* (VQIINK) have been identified as major drivers of Tau aggregation. Furthermore, there is much evidence for the presence of extracellular Tau aggregates and their role in the propagation of Tau pathology. This fact highlights that extracellular and intracellular treatment may be equally important in disease prevention. A variety of Tau aggregation inhibitors have been described, including methylene blue (LTMX), which has already been tested in several clinical trials. The use of small D-amino acid-containing peptides to prevent pathological aggregation and proliferation of Tau could provide an alternative to other chemical agents. D-peptides have been shown to be protease stable and less immunogenic than L-peptides, making them suitable for in vivo applications. Therefore, the aim of this work was to develop novel therapeutic D-peptides as inhibitors of Tau fibrillisation. Using phage display selection against full-length Tau protein (TauFL), a novel Tau-binding L-peptide was selected and its D-amino acid-containing version ISAD1 or its retro-inverse form ISAD1rev was synthesized. This ISAD1rev peptide was composed of the identical amino acids only in reverse order. By means of the thioflavin test (ThT), a fluorescent dye that specifically binds to the amyloid β-sheet structures formed in Tau fibrils, the inhibitory properties of the D-peptides on Tau fibrillisation were investigated. Interestingly, the new D-peptides described here inhibited not only the aggregation of TauFL but also the fibrillisation of disease-relevant Tau mutant forms of other tauopathies, giving the D-peptides a broader range of applications. While ISAD1rev showed only moderately suitable inhibitory properties for Tau aggregation, more promising therapeutic properties emerged for ISAD1. In addition, the binding properties of the D-peptides to different Tau isoforms and Tau conformers were tested in the ELISA. By using different Tau isoforms, PHF6 was identified as a binding site of ISAD1. A conformer-specific binding of the D-peptides to non-fibrillar Tau or Tau fibrils was not detected. After investigating the mechanism of inhibition in more detail using dynamic light scattering (DLS), it was found that the D-peptides ISAD1 and ISAD1rev induce the formation of large, high molecular weight Tau aggregates that lacked the typical ThT-negative β-sheet conformation of conventional Tau aggregates. Based on this fact, it was hypothesised that these might be putative amorphous aggregates. Penetration of D-peptides into neuronal cells is essential as a subsequent AD therapeutic. Cell culture experiments confirmed the uptake of ISAD1 and ISAD1rev from neuronal cells, using the Tau-expressing cell line N2a-TauRDΔK. In further cell culture studies on the cytotoxicity of the D-peptides, no impairment of viability or metabolic activity was detected after incubation with the D-peptides. The high molecular weight putative Tau peptide aggregates detected in the DLS measurements were shown not to induce cytotoxic effects in neuronal cells. In addition, it was shown that the D-peptides led to detoxification of intracellular Tau fibrils by presumably converting the toxic Tau aggregates into a non-toxic high molecular weight form. In summary, our novel D-enantiomeric peptides inhibit the fibril formation of tau and various tau mutant forms and prevent the toxic effects of tau fibrils by preventing the formation of conventional fibrils. These research findings make our peptides a potential therapeutic molecule to prevent tau pathology in AD and other tau-associated diseases. The investigation of blood-brain barrier (BBB) permeability, the detailed mechanism of action and the full therapeutic potential of the D-peptides need to be demonstrated in future in vivo treatment studies. The D-peptides developed in this project have the potential to act both intracellularly and extracellularly, halting the spread of toxic tau species, in different brain regions. A future therapeutic approach to AD should address protein misfolding, protein aggregation and the spread of soluble toxic moieties. According to all findings, the D-peptide ISAD1 could be a promising drug candidate in the fight against AD.

Abstract

Aktuell leiden etwa 55 Millionen Menschen weltweit an einer Demenz. Die Alzheimersche Demenz (AD) ist die häufigste Demenzursache, auf die schätzungsweise 60 % bis 80 % der Fälle fallen. Die AD ist eine fortschreitende neurodegenerative Störung, die hauptsächlich ältere Erwachsene betrifft. Es wird angenommen, dass die neurologischen Veränderungen der AD Jahre oder Jahrzehnte vor dem Auftreten von Symptomen einsetzten. Sie beginnt mit Veränderungen im Gehirn, die von den Betroffenen zunächst nicht bemerkt werden. Erst nach Jahren der Hirnveränderungen kommt es zu spürbaren Symptomen wie Gedächtnisverlust und Sprachproblemen. Die Symptome treten auf, weil Nervenzellen in Teilen des Gehirns, die für die Wahrnehmung, das Lernen und das Gedächtnis (kognitive Funktionen) zuständig sind, geschädigt oder zerstört wurden. Mit dem Fortschreiten der Krankheit breitet sich die Pathologie in weiteren Teilen des Gehirns aus, bis es Betroffenen schließlich nicht mehr möglich ist, grundlegende Körperfunktionen wie Gehen und Schlucken auszuführen. Im Endstadium der Erkrankung werden die Betroffenen bettlägerig und benötigen rund um die Uhr Pflege. Die Hauptpathologien der AD sind die Anhäufung des Proteinfragments Beta-Amyloid (sogenannte Aβ-Plaques) außerhalb der Nervenzellen im Gehirn und Ablagerungen des Tau-Proteins (sogenannte Tau-Tangles) innerhalb der Nervenzellen. Diese Veränderungen gehen mit dem Absterben von Nervenzellen und der Beschädigung von Hirngewebe einher, die wiederum zu Entzündungen und zum Rückgang des Hirnvolumens (Atrophie) führen. Eine sichere Diagnose kann aktuell nur nach dem Tod gestellt werden und keine der heute verfügbaren Medikamente für AD verlangsamen oder stoppen die Schädigung und Zerstörung von Nervenzellen, sodass lediglich eine symptomatische Behandlung verfügbar ist. Viele potenzielle therapeutische Substanzen für AD, die mit der Aβ-Pathologie in Zusammenhang stehen, wurden erfolgreich in präklinischen Modellen getestet, aber die meisten von ihnen scheiterten in klinischen Studien aufgrund von mangelndem therapeutischem Nutzen oder unerwünschten Nebenwirkungen. Die US-Arzneimittelbehörde FDA hat Aducanumab, ein Aβ-Antikörper, als einziges Medikament zugelassen, das möglicherweise das Fortschreiten der AD verlangsamen kann, dennoch ist die Zulassung umstritten und die Wirksamkeit von Aducanumab muss in weiteren Studien nachgewiesen werden. Von der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) erhielt Aducanumab aufgrund von nicht nachgewiesener Wirksamkeit und möglichen schwerwiegenden Nebenwirkungen keine Zulassung. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass die Tau-Pathologie im engeren Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Krankheit und den klinischen Symptomen steht, was zu einer verstärkten Erforschung von Tau-assoziierten Wirkstoffen geführt hat. Die Tau-Pathologie tritt nicht nur bei der AD auf, sondern auch bei anderen neurologischen Erkrankungen, den sogenannten Tauopathien, wodurch sich der Anwendungsbereich einer therapeutischen Substanz erweitern lassen könnte. Tau ist ein intrazellulär exprimiertes Protein, das an der Stabilisierung der Mikrotubuli und am axonalen Transport beteiligt ist. Unter pathologischen Bedingungen löst sich Tau von den Mikrotubuli, wodurch diese zerfallen und das ungebundene Tau kann unter Umständen zu Oligomeren oder gepaarten helikalen Filamenten (PHFs) aggregieren. Die zwei Hexapeptid-Sequenzen PHF6 (VQIVYK) und PHF6* (VQIINK) wurden als wesentliche Antreiber der Tau-Aggregation identifiziert. Weiterhin gibt es viele Hinweise auf das Vorhandensein extrazellulärer Tau-Aggregate und ihre Rolle bei der Ausbreitung der Tau-Pathologie. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die extrazelluläre und intrazelluläre Behandlung bei der Krankheitsprävention gleich wichtig sein könnte. Es sind eine Vielzahl von Tau-Aggregationsinhibitoren beschrieben, darunter Methylenblau (LTMX), was bereits in mehreren klinischen Studien getestet wurde. Die Verwendung von kleinen D-Aminosäure (AS)-haltigen Peptiden (im nachfolgenden D-Peptide genannt) zur Verhinderung der pathologischen Aggregation und Verbreitung von Tau könnte eine Alternative zu anderen chemischen Substanzen darstellen. D-Peptide sind nachweislich proteasestabil und weniger immunogen als L-Peptide, was sie für in vivo-Anwendungen geeignet macht. Daher war das Ziel dieser Arbeit, neuartige therapeutische D-Peptide als Inhibitoren der Tau-Fibrillisation zu entwickeln. Mithilfe einer Phagen-Display-Selektion gegen das Volllänge Tau-Protein (TauFL) wurde ein neuartiges Tau-bindendes L-Peptid selektioniert und seine D-Peptid Version ISAD1 bzw. seine retro-inverse Form ISAD1rev synthetisiert. Mittels Thioflavin-Test (ThT), einem Fluoreszenzfarbstoff der spezifisch an die in Tau-Fibrillen gebildeten amyloiden β-Faltblattstrukturen bindet, wurden die Inhibitorischen Eigenschaften der D-Peptide auf die Tau-Fibrillisation untersucht. Die hier beschriebenen neuen D-Peptide inhibierten interessanterweise nicht nur die Aggregation von TauFL, sondern auch die Fibrillisation von krankheitsrelevanten Tau-Mutationsformen anderer Tauopathien, was den D-Peptiden einen erweiterten Anwendungsbereich verleiht. Während ISAD1rev für die Tau-Aggregation nur mäßig geeignete inhibitorische Eigenschaften aufwies, ergaben sich für ISAD1 vielversprechendere therapeutische Eigenschaften. Zusätzlich wurden im ELISA die Bindeeigenschaften der D-Peptide an verschiedene Tau-Isoformen und Tau-Konformere getestet. Durch die Verwendung von unterschiedlichen Tau-Isoformen wurde PHF6 als eine Bindestelle von ISAD1 identifiziert. Eine Kknformer-spezifische Bindung der D-Peptide an nicht-fibrilliertes Tau bzw. Tau-Fibrillen wurde nicht festgestellt. Nach der näheren Untersuchung des Mechanismus der Inhibition mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS) wurde herausgefunden, dass die D-Peptide ISAD1 und ISAD1rev die Bildung von großen, hochmolekularen Tau-Aggregaten induzieren, denen die typische ThT-negative β-Faltblatt-Konformation herkömmlicher Tau-Aggregate fehlte. Aufgrund dieser Tatsache wurde angenommen, dass es sich dabei um mutmaßliche amorphe Aggregate handeln könnte. Die Aufnahme der D-Peptide in neuronale Zellen ist als späteres AD-Therapeutikum essentiell. In Zellkulturexperimenten konnte die Aufnahme von ISAD1 und ISAD1rev von neuronalen Zellen anhand der Tau-exprimierenden Zellline N2a-TauRDΔK bestätigt werden. In weiteren Zellkulturuntersuchungen zur Zytotoxizität der D-Peptide wurden nach der Inkubation mit den D-Peptiden keine Beeinträchtigungen der Lebensfähigkeit oder der metabolischen Aktivität festgestellt. Die in den DLS-Messungen detektierten hochmolekularen mutmaßlichen Tau-Peptid-Aggregaten lösten nachweislich keine zytotoxischen Effekte bei neuronalen Zellen aus. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die D-Peptide zu einer Detoxifizierung intrazellulärer Tau-Fibrillen führten, indem sie vermutlich die toxischen Tau-Aggregate in eine nicht-toxische hochmolekulare Form überführen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die neuartigen D-Peptide die Fibrillenbildung von Tau und verschiedenen Tau-Mutationsformen inhibieren und die toxischen Wirkungen von Tau-Fibrillen verhindern, indem sie die Bildung herkömmlicher Fibrillen verhindern. Diese Forschungsergebnisse machen unsere Peptide zu einem potenziellen therapeutischen Molekül zur Verhinderung der Tau-Pathologie bei AD und anderen Tau-assoziierten Krankheiten. Die Untersuchung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BHS), der detaillierte Wirkmechanismus und das volle therapeutisches Potenzial der D-Peptide muss in künftigen in vivo-Behandlungsstudien nachgewiesen werden. Die D-Peptide, die in diesem Projekt entwickelt wurden, haben das Potenzial, sowohl intrazellulär als auch extrazellulär zu wirken und somit die Verbreitung der toxischen Tau-Spezies in verschiedenen Hirnregionen, aufzuhalten. Ein zukünftiger Therapieansatz der AD sollte die Protein-Fehlfaltung, Protein-Aggregation und die Verbreitung der löslichen toxischen Einheiten berücksichtigen. Das D-Peptid ISAD1 könnte nach allen Erkenntnissen ein vielversprechender Wirkstoffkandidat im Kampf gegen AD sein.

DOI
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