Die Inhibition der Casein Kinase 2 durch DMAT als Therapieoption bei Pankreaskarzinom

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2011-05-17
Issue Year
2011
Authors
Plötz, Katharina
Editor
Abstract
    1. 1 Background With an incidence of 9-10 new cases every year, pancreatic carcinoma constitutes a cancer in civilian population not to be neglected. Of all its varying forms, the ductal adeno carcinoma occurs most commonly. Today, a lot of different reasons are discussed to be causing its development. Of all the occurances of pancreatic carcinoma, close to 30% are e.g. attributed to smoking. However, certain genetic factors increase the chance of coming down with pancreatic cancer as well. People with Peutz-Jeghers syndrome, HNPCC as well as carriers of the BRCA2-gene are affected more frequently. Aside of these points, Hypercholesterolemia, obesity and a lack of movement combined with an increased BMI contribute to the development of pancreatic carcinoma. Apart from operative therapy, chemotherapy is an important main pillar in the treatment process. Until now, analoges of pyrimidine, gemacitabine and fluorouracile came into action, yet without any satisfactory results so far. As it has already been proved in different studies. Inhibition of Casein Kinasis 2 (CK2) with DMAT does inhibit proliferation and has a proapoptotic effect on vital tumor tissue, in this dissertation, the impacts of treating lines of cells of pancreatic carcinoma in vitro with DMAT were examined. 1.2.2 Methods The anti-proliferatetive respectively proapoptotic effect of the CK2 inhibitor DMAT was tested in vitro applying a variety of methods. After staining with propidiumiodide, the apoptosis rate was quantified by flow cytometry and confirmed after JC-1 staining, an indicator of mitochondrial membrane potential as well as immunecytochemical analyses (M30 Cytodeath), which depicts the fragmentation of cytokeratin 18. The growth rate and cell vitality were determined using colorimetric BrdU-Incorporation-ELISA and specifying the cell number after Trypan blue staining. Ways of signal transduction being relevant for apoptosis were verified by westernblot. Concentrations of 1µmol up to 1000µmol DMAT were used. 1.2.3 Results and Observations DMAT took an inhibiting resp. proapoptotic effect especially in the concentration of 100µmol. In determining the amount of carcinomia cell lines as well as the control cells, the primary prepuce fibroblasts, after 24 hours resp. 48 hours of incubation with DMAT at a topmost concentration of 100 µM, there were nearly no vital cells to be detected. At 50 µM of DMAT, however, a distinctively lower impairment of the cultures was to be observed. Regarding the inhibition of proliferation and induction of apoptosis, the YAPC cells seemed to be a little less impaired in circulatory cytometry as well as in BrdU-ELISA than Panc-89 cells. Even at 100 µM, with this cell line, the relative proliferation rate amounted not less than 97% of the original value of the untreated control sample, whereas with the Panc-89 samples, the growth rate amounted 81% while incubation with the same concentration of DMAT. Regarding the development of the apoptosis considering the duration of incubation, the highest increase with the control fibroblasts is to be detected after 24 hours already, whilst with the carcinoma cells, this is the case only after 48 hours. On top of this, the share of cells which were in the dying-off process was higher here than with the carcinoma cell line. This was confirmed in experiment M30, in which the fragmentation of Cytokeratin-18 was evaluated. Under the microscope, there turned out to be a similarly distinctive fragmentation with HF as well as with YAPC cells, however, the samples differed in the amount of cells that were still available on the whole. With the control fibroblasts, it was still distinctively higher than with the samples of malignoma cells. The quantification of caspasis-3 activity by means of caspasis 3/7 assay was called on for further determination of apoptosis induction. The highest values were present after 48 hours of incubation with the control cell line, whilst this was the case with the carcinoma cells after 24 hours already. For the realisation of the experiments M30 as well as the caspasis-3 measurement, the cells had been treated with a concentration of 100 µM of DMAT. 1.2.4 Practical conclusions All in all, an effect of inhibition of growth and the pro-apoptotic effect were mainly to be observed with a concentration of 100µM of DMAT, lower dosing barely achieved any effect. As this constitutes a very high concentration in the in vitro experiment, it has to be watched in how far the results allow a conclusion towards the future implementation of DMAT on humans.
Abstract

1.1.1 Hintergrund Das Pankreaskarzinom stellt mit einer Inzidenz von etwa 9-10 neuen Fällen pro Jahr eine nicht zu vernachlässigende Krebserkrankung der Zivilbevölkerung dar. Unter den verschiedenen Formen tritt das duktale Adenokarzinom am häufigsten auf. Als Auslöser werden heute sehr viele unterschiedliche Ursachen diskutiert. So schreibt man dem Rauchen beispielsweise nahezu 30 % aller Fälle des Pankreaskarzinoms zu. Genauso aber erhöhen bestimmte genetische Faktoren das Risiko, an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erkranken. Dazu zählen besonders das Peutz-Jeghers-Syndrom, das HNPCC und auch Träger des BRCA2-Gens sind vermehrt betroffen. Neben diesen genetischen Veränderungen spielen aber auch beispielsweise Hypercholesterinämie, Übergewicht und Bewegungsmangel in Kombination mit einem erhöhten BMI eine Rolle bei der Entwicklung eines Pankreaskarzinoms. Neben der operativen Therapie ist ein wichtiges Standbein der Behandlung die Chemotherapie. Bisher kamen Pyrimidinanaloga wie Gemcitabin und Fluorouracil zum Einsatz, jedoch bisher ohne zufriedenstellendes Ergebnis. Da in verschiedenen Studien bereits nachgewiesen wurde, dass eine Inhibition der Casein Kinase 2 (CK2) durch DMAT einen proliferationshemmenden und proapoptotischen Effekt auf vitales Tumorgewebe hat, wurde in dieser Arbeit die Auswirkung der Behandlung von Pankreaskarzinomzelllinien in vitro durch DMAT untersucht. 1.1.2 Methoden Die antiproliferative bzw. proapoptotische Wirkung des CK2 -Inhibitors DMAT wurde in vitro mittels verschiedener Methoden getestet. Die Apoptoserate wurde durchflusszytometrisch nach Propidiumjodidfärbung quantifiziert, sowie durch JC1­Färbung, einem Indikator des mitochondrialen Membranpotentials, und durch immunzytochemische Analysen (M 30 Cytodeath), welche die Zytokeratinfragmentierung anzeigt, bestimmt. Die Wachstumsrate und Zellvitalität wurden mittels eines kolorimetrischen BrdU-Inkorporations-ELISA und durch Bestimmung der Zellzahl nach Trypanblaufärbung ermittelt. Apoptoserelevante Signaltransduktionswege wurden im Westernblot verifiziert. Zum Einsatz kamen Konzentrationen von 1 bis 1000 µmol DMAT. 1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen DMAT wirkte besonders in der Konzentration von 100µM wachstumshemmend bzw. proapoptotisch. In der Zellzahlbestimmung waren bei den Karzinomzelllinien als auch bei den Kontrollzellen, den primären Vorhautfibroblasten nach 24 bzw. 48h Inkubation mit DMAT bei Höchstkonzentration 100µM nahezu keine vitalen Zellen mehr nachweisen. Hingegen ist bei 50µM DMAT eine deutlich geringere Beeinträchtigung der Kulturen zu beobachten. Hinsichtlich Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion erscheinen die YAPC –Zellen in der Durchflusszytometrie sowie im BrdU-ELISA etwas weniger beeinträchtigt als Panc-89-Zellen. So betrug die relative Proliferationsrate bei dieser Zelllinie selbst bei 100µM noch immer 97% des Ausgangswertes der unbehandelten Kontrolle, wogegen bei den Panc-89-Proben die Wachstumsrate unter Behandlung mit derselben Konzentration DMAT sich auf 81% belief. Betrachtet man die Entwicklung der Apoptose unter Berücksichtigung der Inkubationszeit, so lässt sich die größte Steigerung bei den Kontrollfibroblasten bereits nach 24h feststellen, bei den Karzinomzellen erst nach 48h. Zudem war der Anteil der sich im Absterben befindlichen Zellen hierbei auch höher als bei der Kontrollzelllinie. Dies bestätigte sich im Versuch M30, in welchem die Zytokeratin-18-Fragmentierung beurteilt wurde. So zeigte sich unter dem Mikroskop sowohl bei HF als auch bei YAPC-Zellen zwar eine ähnlich ausgeprägte Fragmentierung, jedoch unterschieden sich die Proben hinsichtlich ihrer noch vorhandenen gesamten Zellzahl. Diese war bei den Kontrollfibroblasten noch deutlich höher als bei den Proben der Malignomzellen. Zur weiteren Bestimmung der Apoptoseinduktion wurde die Quantifizierung der Caspase-3-Aktivität mittels Caspase 3/7-Assay herangezogen. Hier lagen in den Proben der Kontrollzelllinie die höchsten Werte nach 48h, bei den Karzinomzellen bereits nach 24h Inkubation vor. Behandelt wurden die Zellen zur Durchführung der Experimente M30 sowie Caspase-3-Messung mit einer Konzentration von 100µM DMAT. 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen Insgesamt konnte ein Effekt auf die Wachstumshemmung und die pro-apoptotische Wirkung hauptsächlich bei Konzentrationen von 100µM beobachtet werden, geringere Dosierungen erzielten kaum eine Wirkung. Da dies eine sehr hohe Konzentration im invitro Versuch darstellt, muss abgewartet werden, inwieweit die Ergebnisse Rückschlüsse auf die Anwendung von DMAT in Zukunft am Menschen erlauben.

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