Modulation des 7SK small nuclear Ribonukleoproteinkomplexes durch das Typ-IV-Effektorprotein AnkG von Coxiella burnetii

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2022-06-27
Issue Year
2022
Authors
Cordsmeier, Arne
Editor
Abstract

The obligate intracellular, Gram-negative bacterium Coxiella burnetii is the causative agent of Q fever. Humans are usually infected by inhalation of contaminated aerosols of animal products. Interestingly, 1-10 bacteria can be sufficient to establish an infection. Q fever occurs in an acute and a chronic form. The chronic form can lead to a lethal endocarditis. Treatment of the chronic form needs doxycycline and chloroquine for up to 18 months. This long-term treatment and the occurrence of the post Q-fever fatigue syndrome, which cannot be treated efficiently, show the urgency of further investigating these bacteria to develop new possibilities of treatment. For successful infection, intracellular survival, and replication C. burnetii utilizes more than 150 effector proteins, which are translocated from bacterial cytoplasm to host cell cytoplasm by a type-4-secretion system. The function of the majority of these effectors is unknown. However, for the effector proteins CaeA, CaeB, and AnkG an anti-apoptotic activity has been described. Amongst them AnkG is the best characterized. Preceding to this work it has been known that the amino acids 1-69 are necessary and sufficient for the anti-apoptotic activity. Furthermore, a nuclear localization for AnkG is essential for its anti-apoptotic effect. This localization is reached by interaction with the host cell proteins p32 and Importin-α1. However, the underlying molecular mechanism was unknown and should be analyzed in the scope of this study. It could be shown that the amino acids 1-28 are necessary and sufficient for the anti- apoptotic activity of AnkG. Besides, the binding of AnkG to the nuclear host cell proteins DDX21, MTA2, CDC5L, hnRNPM, and TSR1 could be confirmed. These proteins are involved in RNA metabolism (e.g. splicing) and regulatory functions in cell survival. Localization analysis by ectopic co-expression of AnkG and the binding partner showed co- localization of AnkG with DDX21, MTA2, and CDC5L within the nucleus. Furthermore, an influence on the localization of MTA2 and CDC5L by AnkG could be shown. In both cases the localization of host cell proteins were altered from a homogenous distribution in the nucleus to a concentrated localization in substructures in the nucleus. For MTA2 and CDC5L it has been shown that localization can be critical for molecular function. CDC5L in turn influences the localization of AnkG by replacing it in substructures in the nucleus. Additionally, AnkG influences the localization of DDX21 after apoptosis induction. AnkG inhibits the migration of DDX21 from the nucleoli to the nucleoplasm leading to an anti- apoptotic phenotype. The interaction between DDX21 and AnkG has been characterized. It could been shown that DDX21 binds with the amino acids 1-28 of AnkG, the anti-apoptotic part. The amino acid 27is critical for this interaction. After mutating this arginine to serine the interaction is disrupted, what could indicate in interaction by salt bridges. Hitherto, it has been known that DDX21 interacts with the 7SK small nuclear ribonucleoprotein complex (7SK snRNP). Therefore, interaction between AnkG and the 7SK snRNP has been analyzed. It could be shown that AnkG also interacts with LARP7, a scaffolding protein of the 7SK snRNP. Additionally, AnkG interacts with the 7SK RNA. This RNA is responsible for the release of the positive transcription elongation factor b (P-TEFb), which can lead to anti-apoptotic transcription activity. Further analysis showed that ectopic expression of AnkG facilitates the release of CDK9, the catalytic subunit of P-TEFb, from the 7SK snRNP. Hence, it was supposed that AnkG might influence host cell transcription. RNA sequencing showed that expression of AnkG leads to upregulation of anti-apoptotic genes while pro-apoptotic genes are downregulated. Furthermore, the data showed an influence of AnkG on genes involved in the cytoskeleton and trafficking as well as encoding transcription factors or are involved in signaling. It could be shown that the mutant AnkG1-28 R27S, which does not bind DDX21, also lose the capability of binding to LARP7 and the 7SK RNA. Since this mutant is not anti-apoptotic anymore, it is obvious that interaction of AnkG with DDX21 and the 7SK snRNP is essential for its anti-apoptotic activity. Using CDK9 inhibitors showed also that depletion of CDK9 leads to a loss of the anti-apoptotic effect of AnkG. In summary, the data showed an interaction of AnkG with DDX21 and the 7SK snRNP and facilitates the release of P-TEFb and CDK9, respectively. This mechanism is critical for the anti-apoptotic activity of AnkG since the depletion of CDK9 leads to a loss of the anti- apoptotic effect. Furthermore, the role of AnkG during infection was analyzed to evaluate a possible importance of the anti-apoptotic activity for the infection. Therefore, an AnkG deletion mutant (∆ankG) was used. In the scope of that it could been shown that ∆ankG has similar infection rates compared to the wild type. However, ∆ankG shows a defect in establishing and maturating of the Coxiella-containing vacuole (CCV). The CCVs of ∆ankG are smaller and there are more vacuoles per cell in comparison to the wild type. The intracellular replication of ∆ankG is impaired as well. However, this defect was independent of the anti-apoptotic activity of AnkG since infection of cells with inhibited intrinsic apoptosis pathways does not rescue the wild type phenotype. In summary, these data show a critical role of AnkG for intracellular replication and CCV maturation. Besides, it could be shown that the host cell protein MTA2 binds the anti-apoptotic part of AnkG. MTA2 is known to facilitate the deacetylation of the transcription factor p53 leading to an inhibition of pro-apoptotic activity. The lysine 120 of p53 is critical for its activation by acetylation. Preliminary mass spectrometry analysis showed an effect of AnkG on p53 acetylation. Expression of AnkG might lead to a deacetylation of lysine 120 of p53 and therefore to inactivation. Furthermore, interaction between AnkG and RNAs, especially non-coding RNAs could be confirmed. However, the consequences of these interactions are unknown and have to be further investigated. In summary, it could been shown that the anti-apoptotic mechanism of AnkG functions via interaction with DDX21 and the 7SK snRNP. Additionally, AnkG is involved in intracellular replication and the maturation of the CCV.

Abstract

Das obligat intrazelluläre, Gram-negative Bakterium Coxiella burnetii ist der Erreger des Q- Fiebers. Eine humane C. burnetii Infektion tritt üblicherweise durch Inhalation von kontaminierten Aerosolen tierischer Produkte auf. Hierbei können 1-10 Bakterien ausreichen, um eine Infektion zu etablieren. Für Q-Fieber gibt es eine akute und eine chronische Form, wobei letztere zu einer letalen Endokarditis führen kann. Die Behandlung der chronischen Form erfordert die Gabe von Doxycyclin und Chloroquin über einen Zeitraum von 18 Monaten. Diese lange Therapiedauer sowie das Auftreten eines Post Q-Fieber fatigue Syndroms, für das es keine gezielte Therapie gibt, machen die weitere Erforschung des Bakteriums notwendig, um verbesserte Therapien zu entwickeln. Für die Etablierung der Infektion und die intrazelluläre Replikation ist das Typ-4- Sekretionssystem essentiell, durch das C. burnetii mehr als 150 Effektorproteine vom bakteriellen Zytoplasma in das Wirtszellzytoplasma transloziert. Von den meisten dieser Effektorproteine ist die Funktion unbekannt. Doch für einige wurde eine Funktion beschrieben. So konnte festgestellt werden, dass die Effektorproteine CaeA, CaeB und AnkG anti-apoptotisch auf die Wirtszelle wirken und somit dazu beitragen das intrazelluläre Überleben der Bakterien zu fördern. Hierbei ist AnkG das am besten charakterisierte anti- apoptotische Effektorprotein. Vor Anfertigung dieser Arbeit war bekannt, dass die Aminosäuren 1-69 von AnkG ausreichend und notwendig für die anti-apoptotische Aktivität sind. Zudem ist eine nukleäre Lokalisation von AnkG kritisch für die anti-apoptotische Wirkung. Diese Lokalisation wird durch die Interaktion mit den Wirtszellproteinen p32 und Importin-α1 erreicht. Der molekulare Mechanismus der anti-apoptotischen Aktivität von AnkG war unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit analysiert werden. So konnte festgestellt werden, dass die Aminosäuren 1-28 notwendig und ausreichend für die anti-apoptotische Aktivität von AnkG sind. Zudem wurden die Bindung der nukleären Wirtszellproteine DDX21, MTA2, CDC5L, hnRNPM und TSR1 an AnkG verifiziert. Diese Proteine sind alle in den RNA-Metabolismus (z.B. Splicing) oder die Regulation der Zellvitalität involviert. Lokalisationsanalysen bei ektopischer Ko-Expression der Bindepartner mit AnkG ergaben eine Ko-Lokalisation von AnkG mit DDX21, MTA2 und CDC5L im Nukleus. Zudem konnte gezeigt werden, dass AnkG die Lokalisation von MTA2 und CDC5L beeinflusst. In beiden Fällen liegen die Proteine ohne Expression von AnkG homogen im Nukleus verteilt vor und werden bei Ko-Expression mit AnkG in Substrukturen im Nukleus konzentriert. CDC5L hat zudem einen Einfluss auf die Lokalisation von AnkG und verdrängt dieses aus Substrukturen im Nukleus. Sowohl für MTA2 als auch CDC5L wurde beschrieben, dass die Lokalisation wichtig für ihre regulatorischen Funktionen auf die Zellvitalität ist. Die Lokalisation von DDX21 wird ebenfalls durch AnkG beeinflusst, allerdings nur nach Induktion der intrinsischen Apopotose. Hier inhibiert AnkG die Migration von DDX21 aus den Nukleoli in das Nukleoplasma und inhibiert somit die Apoptose. Zunächst wurde die Interaktion von DDX21 und AnkG weiter charakterisiert. Es konnte festgestellt werden, dass DDX21 mit den Aminosäuren 1-28 von AnkG, dem anti-apoptotischen Bereich, interagiert. Hierbei ist das Arginin an Position 27 kritisch. Wird dieses durch ein Serin ersetzt, findet keine Bindung zwischen AnkG und DDX21 mehr statt, was darauf hindeuten könnte, dass die Bindung über eine Salzbrücke erfolgt. Da für DDX21 bekannt ist, dass es mit dem 7SK small nuclear Ribonukleoproteinkomplex (7SK snRNP) interagiert, wurde eine Bindung von AnkG an diesen Komplex untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass AnkG mit LARP7, einem Gerüstprotein des 7SK snRNP, interagiert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass AnkG auch mit der 7SK RNA interagiert. Diese bildet das Rückgrat des Komplexes und ist für die Freisetzung des positiven Transkriptionselongationsfaktors b (P-TEFb) von dem Komplex verantwortlich. Dies kann zu anti-apoptotischer Transkriptionsaktivität führen. Weitere Analysen zeigten, dass bei ektopischer Expression von AnkG eine vermehrte Freisetzung von CDK9, der katalytischen Untereinheit von P-TEFb, stattfindet. Daraus folgte die Hypothese, dass AnkG hierüber Einfluss auf die Transkription der Wirtszelle nehmen könnte. Die Analyse mittels RNA-Sequenzierung ergab, dass bei Expression von AnkG im Vergleich zu einer Kontrolle, vermehrt anti-apoptotische Gene hochreguliert und pro- apoptotische herunterreguliert werden. Zudem zeigten die Daten der RNA-Sequenzierung, dass auch Gene differentiell reguliert werden, die in das Zytoskelett und das Trafficking involviert sind oder für Transkriptionsfaktoren kodieren sowie in das Signaling involviert sind. Mittels Analysen mit der AnkG Mutante AnkG1-28 R27S, die auch nicht mehr mit der 7SK RNA und LARP7 interagiert, konnte festgestellt werden, dass diese Interaktionen kritisch für die anti-apoptotische Aktivität von AnkG sind, da AnkG1-28 R27S nicht mehr anti-apoptotisch wirkt. Zudem konnte mit Hilfe von CDK9-Inhibitoren gezeigt werden, dass auch eine Depletion von CDK9 einen Verlust der anti-apoptotischen Wirkung von AnkG zur Folge hat. Insgesamt konnte also gezeigt werden, dass AnkG mit DDX21 und dem 7SK snRNP interagiert und dabei die Freisetzung des Transkriptionsfaktors P-TEFb beziehungsweise CDK9 fördert. Dieser Mechanismus ist kritisch für die anti-apoptotische Aktivität von AnkG, da eine Depletion von CDK9 zu einem Verlust der anti-apoptotischen Wirkung führt. Es wurde auch die Rolle von AnkG während der Infektion untersucht, um festzustellen, ob die anti-apoptotische Wirkung auch hierfür notwendig ist. Mit Hilfe einer AnkG-Deletionsmutante (∆ankG) konnte festgestellt werden, dass ∆ankG und der Wildtyp gleich gut infizieren. Allerdings liegt offenbar ein Defekt in der Etablierung beziehungsweise Reifung der Coxiella-enthaltenden Vakuole (CCV) vor. Die CCVs von ∆ankG sind kleiner und es liegen mehr Vakuolen pro Zelle vor. Dies zeigt, dass eine Deletion von AnkG einen Defekt bei den Fusionsprozessen zur Bildung der reifen CCV zur Folge hat. Dies hat einen Einfluss auf die intrazelluläre Replikation, die bei ∆ankG im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduziert ist. Dieser Defekt tritt unabhängig von der anti-apoptotischen Aktivität auf, da auch bei einer Infektion von Zellen mit inhibiertem intrinsischen Apoptoseweg mit ∆ankG den wildtypischen Phänotyp nicht wiederherstellt. Insgesamt konnte hier gezeigt werden, dass AnkG neben der anti-apoptotischen Aktivität auch eine Rolle bei der intrazellulären Replikation beziehungsweise der Reifung der CCV spielt. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch das Wirtszellprotein MTA2 mit dem anti-apoptotischen Bereich von AnkG interagiert. Von MTA2 ist bekannt, dass es verantwortlich für die Deacetylierung und damit Inaktivierung des Transkriptionsfaktors p53 ist. Gerade die Deacetylierung des Lysins 120 von p53 verhindert eine pro-apoptotische Aktivität dieses Proteins. Vorläufige Massenspektrometrie-Analysen konnten zeigen, dass unter dem Einfluss von AnkG die Acetylierung von p53 an Lysin 120 hemmt. Auch eine Interaktion mit weiteren RNAs, insbesondere nicht kodierenden RNAs, konnte nachgewiesen werden. Die Konsequenzen dieser Interaktion müssen allerdings noch näher analysiert werden. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass AnkG über die Interaktion mit DDX21 und dem 7SK snRNP anti-apoptotisch wirkt. Zudem spielt AnkG auch eine Rolle bei der Reifung der CCV und damit bei der intrazellulären Replikation.

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