Der Einfluss von Valproinsäure, Carbamazepin, Levetiracetam und Lamotrigin auf die globale DNA Methylierung von antikonvulsiv behandelten Patienten mit Epilepsie unter Berücksichtigung der MTHFR Polymorphismen 688 C>T und 1298 A>C

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2010-11-08
Issue Year
2010
Authors
Bürgel, Georg
Editor
Abstract

1.2.1 Background Epigenetic mechanisms are responsible for the regulation of gene expression. Direct DNA methylation belongs to the most important epigenetic mechanisms, which move into the focus of interest, after complete sequenzing of the DNA. It is known that Valproate leads to a global hypomethylation of the DNA. The influence of further anticonvulsive drugs (Carbamazepine, Lamotrigin, Levetiracetam) on DNA methylation has no yet been investigated. The biochemical consequence of a decrease in methylentetrahydrofolate reductase (MTHFR) activity 3 is equivalent to a deficiency of folat acid and thus leads to disturbances in methionine metabolism. How a decrease of MTHFR function and a simultaneous anticonvulsive medication effect DNA methylation is completely unknown and subject of this study. 1.2.2 Material and methods Through stimulation with Proteinkinase K and Natriumdodecylsulfate (SDS), genomic DNA has been isolated from leucozytes. The measurement of genomic DNA methylation was performed by a modified, non radioactive Cytosin elongation assay, based on a DNA restriction digestion, subsequent fluorescence labelling within an elongation reaction, and observation of fluorescence. The prevailing MTHFR polymorphism was detected through restriction enzyme analysis and following Polymerase Chain Reaction (PCR). 1.2.3 Results Valproate treatment combined with homozygosity for the 677 C>T mutation in the MTHFR gene showed a significant hypomethylation of genomic DNA (p=0,02). Nevertheless, this DNA hypomethylation is based on valproate intake alone, regardless of homozygosity for the 677C>T mutation. Carbamazepine, Levetiracetam and Lamotrigin did not show a significant change of DNA methylation, regardless of the prevailing MTHFR polymorphism. 1.2.4 Conclusions The intake of valproate leads to a global hypomethylation of DNA. The biochemical consequence of a decrease in MTHFR activity is equivalent to a deficiency of folat acid. Folat acid is essential for remethylation of homocysteine, thus providing a link between MTHFR function and DNA methylation status. If substitution of folat acid has a corrective effect on hypomethylation under valproate treatment has to be investigated in further studies. Measurement of global methylation permits to make a general statement on methylation status, but does not permit a precise prediction about promoter methylation of tissue specific genes. Few genes which are induced through valproate effected hypomethylation are known. Carbamazepine, levetiracetam or lamotrigin treatment may also lead to the induction of certain genes. 4 If this is the case and what possible consequences could come along has to be investigated in further studies.

Abstract

1.1.1 Hintergrund und Ziele Die Regulation der Genexpression unterliegt epigenetischen Mechanismen. Diesen epigenetischen Mechanismen, zu deren wichtigsten die direkte DNA Methylierung zählt, kommt, nach der vollständigen Sequenzierung der DNA, wachsende Bedeutung zu. Von Valproinsäure ist bekannt, dass sie zu einer globalen Hypomethlyierung der DNA führt. Der Einfluss der anderen untersuchten Antikonvulsiva (Carbamazepin, Lamotrigin, Levetiracetam) auf die DNA Methylierung ist unbekannt. Eine Minderfunktion der Methylentetrahydrofolate Reduktase (MTHFR) entspricht in seiner biochemischen Konsequenz einem Folsäuremangel und führt zu einem Sistieren des Homocysteinstoffwechsels. Wie sich eine Reduktion der MTHFR Tätigkeit bei gleichzeitiger Einnahme von Antikonvulsiva auf die globale DNA Methylierung auswirkt ist unbekannt und soll in vorliegender Arbeit untersucht werden. 1.1.2 Material und Methoden Aus EDTA Blut wurde genomische DNA präpariert, indem die Erythrozyten hämolysiert und die Leukozyten isoliert wurden. Aus deren Kernen wurde durch Kern- und Zellaufschluss mit Natriumdodecylsulfat (SDS) und Proteinkinase K gDNA isoliert. Die Messung der genomischen DNA Methylierung erfolgte mit einem modifizierten, nicht radioaktiven Cytosin – Elongationsassay, beruhend auf einem DNA Restriktionsverdau, einer Fluoreszenzmarkierung mittels Elongationsreaktion und abschließender Fluoreszenzbestimmung. Der jeweils vorliegende MTHFR Polymorphismus wurde durch Restriktionsverdau und anschließende Polymerase – Kettenreaktion (PCR) detektiert. 2 1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Von den untersuchten Antikonvulsiva bewirkt ausschließlich Valproinsäure, bei Vorliegen der homozygoten Mutation des MTHFR Polymorphismus 677 C>T, eine signifikante DNA Hypomethylierung. Diese ist allerdings auf die Einnahme per se, und nicht auf das Vorhandensein der homozygoten Mutation zurückzuführen. Carbamazepin, Levetiracetam und Lamotrigin bewirken unabhängig vom vorliegenden MTHFR Polymorphismus keine signifikanten Änderungen der DNA Methylierung. 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen Valproinsäureeinnahme führt zu einer globalen DNA Hypomethylierung. MTHFR Mangel entspricht in seiner biochemischen Konsequenz einem Folsäuremangel. Folsäure ist für die Remethylierung von Homocystein essentiell. Über diesen Mechanismus besteht ein Zusammenhang zur DNA Methylierung. Ob eine Folsäuresubstitution einen korrigierenden Effekt auf die Hypomethylierung der DNA unter Valproinsäureeinnahme hat, muss in weiteren Studien untersucht werden. Die globale Methylierung kann einen Trend anzeigen, lässt aber keine präzise Aussage über die promotorspezifische Methylierung gewebsspezifischer Gene zu. Einige Gene, die aufgrund einer Valproinsäure vermittelten Hypomethylierung induziert werden, sind bekannt. Eine Geninduktion durch Carbamazepin, Levetiracetam oder Lamotrigin ist im Einzelnen ebenso denkbar. Ob dies der Fall ist und mit welchen möglichen Konsequenzen, müssen weitere Untersuchungen zeigen.

DOI
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