Forschungsarbeit zur individuellen Strahlenempfindlichkeit unter Betrachtung des Auftretens und der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch γH2AX und PML nach ex vivo Bestrahlung

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2020-03-16
Issue Year
2020
Authors
Tiefel, Phillip
Editor
Abstract
  1. Summary 2.1. Background and objectives In current guidelines regarding therapy of rectal carcinoma, as well as lung carcinomas and bronchial carcinomas respectively, there are also stated exact parameters for radiation therapy. However, clinical studies showed a considerable discrepancy in radio sensitivity between-subjects. On the one hand there are efforts to reduce therapy related side effects, on the other hand it is a matter of particular interest to maximize radiation dosage in patients with less radiation sensitivity, in order to achieve a higher number of eradicated malignant cells. Thus, a reliable test regarding radiation sensitivity is essential to estimate the maximum possible irradiation dosage without related damages before starting therapy. This would offer the possibility to adjust the dosage for each patient individually. In this study our ambition was to be able to detect the patient’s individual radiation sensitivity by irradiating a blood sample ex vivo and afterwards analysing it with immunofluorescence microscopy, both before starting the radio therapy. 2.2. Methods In this research study we analysed the individual presence of enzymes and repair processes of DNA double-strand breaks caused by radiation using immunofluorescence microscopy by labelled H2AX and PML enzymes. Before beginning the therapy we took a venous blood sample of each patient. Blood samples were taken again of patients with rectal or bronchial carcinoma one and three weeks after beginning the therapy, respectively. Of these blood samples we separated the white mononuclear cell layer, extracted the lymphocytes and split it into three fractions. One fraction was unirradiated at all in order to have a control level, one was irradiated with a dosage of 0,5 Gy and one with 2 Gy. After a varying period of time of repair processes, the H2AX- and PML enzymes were labelled with immunofluorescence and photographed with a microscope, as well as analysed by a semiautomatic software. In doing so, we measured the enzymes H2AX and PML and further parameters such as for example luminosity and expanse of the formed foci, colocalisation between the foci of the two enzymes, as well as the total amount of DNA per cell. In addition to that the data was tested for its age distribution. In a final step we correlated the data with data of two FISH studies of the same cohort of patients. The study included 100 patients with rectal carcinoma, 24 with bronchial carcinoma and 17 patients who are very sensitive to radiotherapy. This cohort was compared with a control-cohort of 44 individuals. 2.3. Results The study showed a higher number of H2AX-foci after irradiation with 2 Gy in patients who are sensitive to radiotherapy compared to other included individuals. The labelled enzyme γH2AX also showed considerable variations in other parameters within the different cohorts. This discrepancy of values was not detected with the immunostained anti PML antibodies. The number and activity of the PML enzymes was nearly identical within the cohorts, regardless of irradiation dosage and repair time. Even other parameters of the PML enzymes remained almost constant compared to the γH2AX labelled antibodies. Correlating the age of the patients of the 2 Gy measurements of the rectal carcinoma group and the control group, there was no coherence of both parameters. Also, there was no statistically significant correlation between the data of the revised 2 Gy measurements of rectal carcinoma and bronchial carcinoma patients correlated with the results of the FISH studies. 2.4. Conclusion The long-term objective of this study is to enable a therapy as effective and mild as possible for patients with carcinoma who are in need of a radiotherapy because of their advanced or current state of disease. In order to detect the individual radio sensitivity and find the adequate dosage, we analysed a multitude of parameters with immunofluorescence assay. After evaluating the data some of the parameters turned out to be promising predictors for radio sensitivity, although we have to emphasize that none of the examined parameters can be used alone to analyse radio sensitivity. The individual radio sensitivity is a complexity of individual and environmental, as well as polygenetic factors. None of the predictive markers known so far, can be used alone for a risk assessment before beginning radiotherapy. However, some of the data, for example number of H2AX-foci per cell after ex vivo irradiation, show consistent values and could possibly be a first indicator for a higher level of radio sensitivity. The approach of further investigation should be to find parameters and predictors, which could be used as a routine testing to identify the individual radio sensitivity of patients
Abstract
  1. Zusammenfassung 1.1. Hintergrund und Ziele In den derzeit geltenden Leitlinien sowohl der Therapie des Rektumkarzinoms als auch des Lungen- bzw. Bronchialkarzinoms werden feste Therapieregime auch für die Radiotherapie vorgegeben. Es konnte jedoch bereits durch klinische Studien belegt werden, dass eine deutliche Diskrepanz der interindividuellen Strahlenempfindlichkeit existiert. Nun wird einerseits versucht die therapieassoziierten Strahlenschäden zu minimieren, andererseits wäre es von großem Interesse bei Patienten mit geringer Strahlenempfindlichkeit die Dosis zu maximieren um die Eradikationsrate von malignen Zellen zu erhöhen. Um diese beiden Parameter, minimaler Behandlungsschaden und maximale nichtschädliche Dosis, vor Therapie gegeneinander abwägen zu können wäre eine verlässliche prätherapeutische Testung auf Strahlenempfindlichkeit wünschenswert. Dies würde eine individuelle Dosisanpassung ermöglichen. In der durchgeführten Studie war es unser Bestreben vor Beginn einer Strahlentherapie, nach ex vivo Bestrahlung einer Blutprobe und anschließender immunfluoreszenz-mikroskopischer Auswertung, eine Aussage über die individuelle Strahlenempfindlichkeit eines Patienten treffen zu können.

1.2. Methoden In dieser Forschungsarbeit wurde die individuelle Enzymausstattung und der Reparaturprozess, der durch Strahlung hervorgerufenen DNA-Doppelstrangbrüche, durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie der markierten H2AX- und PML-Enzyme gemessen. Vor Therapiebeginn wurde den Patienten eine venöse Blutprobe entnommen. Bei den Rektum- und Bronchialkarzinom-Patienten wurden weitere Blutproben, eine bzw. drei Wochen nach Therapiestart, gewonnen. Aus diesem Material wurden die Lymphozyten extrahiert und in drei Teile separiert. Ein Teil der Probe blieb unbestrahlt zur Messung eines Hintergrundwertes, die beiden anderen Teile wurden mit 0,5Gy bzw. 2Gy ex vivo bestrahlt. Nach unterschiedlichen Reparaturzeiten wurden die H2AX- und PML-Enzyme immunfluoreszenzmarkiert und im Anschluss mikroskopisch aufgenommen sowie durch eine halbautomatische Analysesoftware ausgewertet. Hierbei wurden neben den beiden Enzymen H2AX und PML auch weitere Parameter, wie beispielsweise Helligkeiten und Fläche der entstandenen Foci, Kolokalisationen zwischen den Foci der beiden Enzyme sowie eine Gesamt-DNA-Menge je Zelle, gemessen. Zusätzlich wurden die Daten auf ihre Altersverteilung überprüft. Zuletzt wurden die gemessenen Werte mit Daten zweier FISH-Fremdstudie der gleichen Patientenkohorte korreliert. In die Studie wurden 100 Rektumkarzinom-, 24 Bronchialkarzinom- und 17 strahlenempfindliche Patienten eingeschlossen. Diese wurden mit einem Kollektiv von 44 Kontroll-Probanden verglichen.

1.3. Ergebnisse und Beobachtungen In der durchgeführten Untersuchung zeigten sich bei den strahlenempfindlichen Patienten nach 2Gy Bestrahlung deutlich erhöhte Werte der H2AX-Foci im Vergleich zu den anderen Kohorten. Die Enzymmarkierung von γH2AX zeigte auch bei anderen Messgrößen deutliche Schwankungen zwischen den verschiedenen Studiengruppen. Diese Diskrepanz der Werte konnte bei den immunfluoreszenz-markierten Anti-PML-Antikörper nicht nachgewiesen werden. Die Anzahl sowie die Aktivität der PML-Enzyme blieb in allen Gruppen, unabhängig von Strahlendosis und Reparaturzeitraum, annähernd gleich. Auch andere Parameter der PML-Enzyme blieben im Gegensatz zu den γH2AX-markierten Antikörper nahezu konstant. Die Korrelation der 2Gy-Messwerte der Rektum- und Kontrollgruppe mit dem Alter der Patienten wies keinen klaren Zusammenhang der beiden Parameter aus. Die Daten der korrigierten 2Gy-Messungen, von Rektum- und Bronchialkarzinom-Patienten, korreliert mit den Ergebnissen dieser Patienten in den beiden FISH-Fremdstudien zeigten keine statistisch belastbare Abhängigkeit zueinander.

1.4. Praktische Schlussfolgerungen Das langfristige Ziel dieser Arbeit ist es Karzinom-Patienten, welche aufgrund ihrer fortgeschrittenen Krankheit oder dem aktuellen Stadium der Erkrankung, auf eine Strahlentherapie angewiesen sind, eine möglichst effiziente und zugleich maximal schonende Therapie durch Photonenstrahlung zukommen zu lassen. Um eine Analyse der individuellen Strahlenempfindlichkeit und darauf aufbauend eine genaue Dosisadaption zu ermöglichen, wurden hier eine Vielzahl von Parametern durch Immunfluoreszenzverfahren untersucht. Nach Auswertung der gewonnen Daten zeigen sich einige Kenngrößen als interessante Prädiktoren der individuellen Strahlenempfindlichkeit. Leider muss im Umkehrschluss klar benannt werden, dass keiner dieser untersuchten Faktoren als alleiniger Parameter für eine Strahlenempfindlichkeitsanalyse ausreicht. Die individuellen Strahlenempfindlichkeit stellt ein komplexes System aus einer Vielzahl von individuellen und umweltbedingten Einflussgrößen sowie polygenetischer Faktoren dar. Kein bisher bekannter Biomarker reicht als Einzelwert für eine Risikoabschätzung vor Strahlentherapie aus. Jedoch zeigen einige Messwerte, wie bspw. die Anzahl der H2AX-Foci je Zelle nach ex vivo-Bestrahlung, konsistente Werte und können einen ersten Hinweis auf eine möglicherweise erhöhte Strahlenempfindlichkeit geben. Ansatz weiterer Forschung muss sein, eine Mehrzahl von Parametern und Prädiktoren zu identifizieren, die als zukünftiger Standard eine schlüssige, präinterventionelle Aussage über die individuelle Strahlenempfindlichkeit eines Patienten zulassen.

DOI
Faculties & Collections
Zugehörige ORCIDs