Entwicklung eines neuartigen, induzierbaren Baculovirus-Insektenzell-Expressionssytems
Development of a novel, inducible baculovirus-insect cell-expression systems
Please always quote using this URN: urn:nbn:de:bvb:29-opus4-100119
- Baculoviren sind hochgradig wirtsspezifische Viren, die zum einen im Rahmen des Baculovirus-Insektenzell-Expressionssystems zur Expression rekombinanter Proteine und zum anderen als Biopestizid bei der Bekämpfung von Fraß-Schädlingen bei einer Vielzahl von Nutzpflanzen eingesetzt werden können. Bisher ist die Anwendung als Expressionssystem auf nicht-toxische Proteine beschränkt, da die Toxizität der Proteine sich negativ auf die Vitalität der Insektenzellen auswirkt, wodurch die Ausbeute an rekombinantem Protein drastisch sinkt. Dies gilt auch für die Vermehrung rekombinanter Baculoviren, die zum Einsatz im Pflanzenschutz ein rekombinantes Protein exprimieren, welches die insektizideBaculoviren sind hochgradig wirtsspezifische Viren, die zum einen im Rahmen des Baculovirus-Insektenzell-Expressionssystems zur Expression rekombinanter Proteine und zum anderen als Biopestizid bei der Bekämpfung von Fraß-Schädlingen bei einer Vielzahl von Nutzpflanzen eingesetzt werden können. Bisher ist die Anwendung als Expressionssystem auf nicht-toxische Proteine beschränkt, da die Toxizität der Proteine sich negativ auf die Vitalität der Insektenzellen auswirkt, wodurch die Ausbeute an rekombinantem Protein drastisch sinkt. Dies gilt auch für die Vermehrung rekombinanter Baculoviren, die zum Einsatz im Pflanzenschutz ein rekombinantes Protein exprimieren, welches die insektizide Wirkung der Viren verstärken soll, da hier ebenfalls verminderte Virusausbeuten aufgrund der reduzierten Vitalität der Insektenzellen beschrieben wurden. Diese Problematik könnte durch den Einsatz induzierbarer Promotoren zur Steuerung der Expression des rekombinanten Proteins umgangen werden. Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit die beiden induzierbaren Promotoren PTight aus dem Tet-Off System und Metallothionein-Promotor (Pmtn) aus Drosophila im BEVS untersucht.
Hierfür wurden die benötigten Genkonstrukte in E. coli kloniert und die rekombinanten Viren anschließend über eine Transfektion in Sf21-Insektenzellen hergestellt. Beide Promotoren zeigten in infizierten Sf21-Insektenzellen Aktivität und ließen sich über die eingestellten Induktor-Konzentrationen regulieren. Beim Pmtn führte die Verwendung von CuCl2 zu einer stärkeren Induktion als CuSO4, wobei die höchste Expression des Reporterproteins eGFP bei einer Konzentration von 800 μM CuCl2 festgestellt werden konnte. Höhere Cu2+-Konzentrationen resultierten in einer rapiden Verschlechterung der Zellviabilität einhergehend mit einer Reduktion der eGFP-Synthese. Der Pmtn zeigte in Abwesenheit seines Induktors nur schwache Basalaktivität und konnte durch Zugabe von 800 μM CuCl2 50-fach induziert werden. Die Untersuchung der Kinetik ergab, dass eGFP bereits 10 h nach Induktion nachgewiesen und die höchste Produktionsrate in den darauf folgenden 30 h verzeichnet werden konnte. Während eine Induktion 12 hpi zur stärksten eGFP-Produktion geführt hat, konnte der Pmtn auch bis 48 hpi noch induziert werden, allerdings mit stark reduzierten Ausbeuten. Durch die frühe Aktivität des Pmtn wäre dieser auch für die Produktion glykosylierter Proteine geeignet.
Der PTight besitzt in Abwesenheit seines Transaktivators tTA nur eine sehr geringe Basalaktivität, die durch Hemmung der Genexpression mittels Doxycyclin jedoch nicht vollständig erreicht werden kann. Die minimale Doxycyclin-Konzentration, die zur maximalen Hemmung der PTight-gesteuerten Genexpression führt, beträgt je nach Kultivierungssystem 10 - 20 ng∙mL-1 und bewirkt eine Reduktion der eGFP-Produktion um 87 - 96 %. Eine Induktion des PTight durch Entfernen des Doxycyclins konnte bis 48 hpi nachgewiesen werden, wobei die höchste eGFP-Produktion bei einer Induktion zum Zeitpunkt 24 hpi beobachtet werden konnte. Da die Aktivierungskinetik des PTight auch von der zeitlichen Expression des Transaktivators tTA abhängig ist, die durch den sehr späten Polyhedrin-Promotor (Ppolh) reguliert wird, konnte die Produktion von eGFP erst ca. 30 hpi detektiert werden. Sie stieg daraufhin allerdings bis 116 hpi stetig an.
Der Vergleich der Maximalexpressionen der beiden induzierbaren Promotoren PTight und Pmtn mit dem Standardpromotor des BEVS, dem sehr starken Ppolh, hat ergeben, dass der Pmtn etwa 4 % und der PTight 2 % des Ppolh erreicht, weshalb eine Optimierung der beiden Systeme sinnvoll erscheint. Eine gewisse verminderte Produktivität kann allerdings aufgrund des Vorteils der Regulierbarkeit der Promotoren in Kauf genommen werden.
Neben der Charakterisierung der Promotoren wurde die Bildung von egfp--Deletionsmutanten durch mehrfaches Passagieren der Virusstocks untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil egfp-positiver Viren bereits nach fünf Passagen auf ca. 50 % abfällt und nach elf Passagen weniger als 1 % beträgt. Zusätzlich zu den egfp-negativen Deletionsmutanten sind auch noch weitere Mutanten entstanden, denen beispielsweise die zur Replikation benötigten Gene fehlen und die sich daher nur in Anwesenheit eines intakten Helfer-Virus vermehren können. Diese Mutanten werden als defective interfering particles (DIPs) bezeichnet. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass DIPs sich nicht nur negativ auf die Produktion des rekombinanten Proteins eGFP, sondern auch auf die Virusausbeute auswirken. Deshalb wird empfohlen möglichst immer mit Virusstocks niedriger Passagen zu arbeiten und bei der Vermehrung von Viren sehr kleine MOI im Bereich von 0,001 bis 0,01 einzusetzen.…
- Baculoviruses are highly host-specific viruses which can be used in the context of the baculovirus-insect cell expression system (BEVS) for expressing recombinant proteins as well as a biopesticide to control feeding pests in a variety of agricultural crops. So far, the application as an expression system is limited to non-toxic proteins, since the toxicity of the proteins would have a negative effect on the viability of the insect cells, whereby the yield of recombinant protein decreases dramatically. This also applies to the propagation of recombinant baculoviruses expressing a recombinant protein for the usage in plant protection. Reduced virus yields due to the reduced vitality of theBaculoviruses are highly host-specific viruses which can be used in the context of the baculovirus-insect cell expression system (BEVS) for expressing recombinant proteins as well as a biopesticide to control feeding pests in a variety of agricultural crops. So far, the application as an expression system is limited to non-toxic proteins, since the toxicity of the proteins would have a negative effect on the viability of the insect cells, whereby the yield of recombinant protein decreases dramatically. This also applies to the propagation of recombinant baculoviruses expressing a recombinant protein for the usage in plant protection. Reduced virus yields due to the reduced vitality of the insect cells expressing a protein to enhance the insecticidal activity of the virus have also been reported. This issue could be circumvented by the use of inducible promoters to control the expression of the recombinant protein. For this reason, the two inducible promoters PTight from the Tet-Off system and Drosophila metallothionein promoter (Pmtn) were investigated in the context of the BEVS in this work.
For this purpose, the required gene constructs were cloned in E. coli and subsequently, the recombinant viruses were produced by transfection into Sf21 insect cells. Both promoters showed activity in infected Sf21 insect cells and could be regulated by different inducer concentrations. With Pmtn, the use of CuCl2 led to a stronger induction than CuSO4, whereupon the highest expression of the reporter protein eGFP was found at a concentration of 800 μM CuCl2. Higher Cu2+ concentrations resulted in a rapid decrease in cell viability linked with a reduction in eGFP synthesis. Pmtn showed only weak basal activity in the absence of its inducer and could be induced 50-fold by addition of 800 μM CuCl2. Examination of the kinetics revealed that eGFP was already detected 10 h after induction and that the highest production rate was recorded in the subsequent 30 h. While an induction at 12 hpi led to the highest level of eGFP production, Pmtn could still be induced up to 48 hpi, but with greatly reduced yields. Due to the early activity of Pmtn it would also be suitable for the production of glycosylated proteins.
PTight has only a very low basal activity in the absence of its transactivator tTA, which, however, cannot be fully achieved by inhibiting gene expression by doxycycline. Depending on the cultivation system, the minimal doxycycline concentration, which results in maximum inhibition of PTight-controlled gene expression, is 10 - 20 ng∙mL-1 and causes a reduction in eGFP production by 87 - 96 %. Induction of PTight by removal of the doxycycline could be detected up to 48 hpi, whereby the highest eGFP production could be observed after an induction at 24 hpi. Since the activation kinetics of PTight are also dependent on the temporal expression of the transactivator tTA, which in turn is regulated by the very late polyhedrin promoter (Ppolh), the production of eGFP could not be detected until about 30 hpi. Thereafter it increased steadily to 116 hpi.
The comparison of the maximum expressions of the two inducible promoters PTight and Pmtn with the standard promoter of the BEVS, the very strong Ppolh, has revealed that Pmtn reaches about 4% and PTight about 2% of the Ppolh, so that optimization of the two systems appears reasonable. However, some reduced productivity can be accepted due to the advantage of the inducibility of the promoters.
Besides the characterization of promoters, the formation of egfp- deletion mutants was investigated by multiple passages of virus stocks. It could be shown that the proportion of egfp+ viruses drops to approx. 50 % after only five passages and less than 1 % after eleven passages. In addition to the egfp- deletion mutants, other mutants have emerged which, for example, lack the genes required for replication and therefore can only proliferate in the presence of an intact helper virus. These mutants are referred to as defective interfering particles (DIPs). This work shows that DIPs not only negatively affect the production of the recombinant protein eGFP but also impact virus yield. That’s why it is recommended to always work with virus stocks of the lowest possible passages and very small MOI in the range of 0.001 to 0.01.…
Author: | Ricarda Friebe |
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Persistent identifiers - URN: | urn:nbn:de:bvb:29-opus4-100119 |
Referee: | Rainer Buchholz |
Advisor: | Rainer Buchholz |
Document Type: | Doctoral Thesis |
Language: | German |
Year of publication: | 2018 |
Date of online publication (Embargo Date): | 2018/10/17 |
Publishing Institution: | Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) |
Granting institution: | Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), Technische Fakultät |
Acceptance date of the thesis: | 2018/10/05 |
Release Date: | 2018/10/29 |
Tag: | Induzierbare Promotoren; Proteinexpression |
SWD-Keyword: | Baculovirus |
Length/size: | 236 |
Institutes: | Technische Fakultät / Department Chemie- und Bioingenieurwesen |
Dewey Decimal Classification: | 6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 62 Ingenieurwissenschaften / 629 Andere Fachrichtungen der Ingenieurwissenschaften |
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