In vivo Metabolismus-Studien und Human-Biomonitoring von Monoterpenen

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2015-09-17
Issue Year
2015
Authors
Schmidt, Lukas
Editor
Abstract

Monoterpenes are biogenic volatile organic compounds with characteristic structure related flavor properties. They are produced by a large variety of plants and microorganisms. Therefore, this class of substances is ubiquitously present and humans are exposed daily via e.g. nutrition and breathing air. In this context, quantitatively the most important monoterpenes are R-limonene which is present in many plants, foods, cosmetics and consumer products, as well as the bicyclic monoterpenes α-pinene and 3-carene which are predominantly produced and emitted by coniferous woods. Whereas oral uptake of aliphatic monoterpenes used as flavor ingredients in foods is generally recognized as safe, the health impact of acute and chronic inhalation exposures is critically appraised. Adverse effects are mainly the irritation or inflammation of mucous membranes as well as histological changes in liver and enzyme induction as observed in animal tests. As a result, a maximum permissible R-limonene concentration in the air at the workplace (MAK-value) of 28 mg/m³ is required in Germany and for the common German population, a hazard guideline value of 10 mg/m³ R-limonene and of 2 mg/m³ bicyclic monoterpenes is defined. Exposure assessment is hitherto mainly performed using air-monitoring. However, this merely provides insight into the external exposure situation and cannot be directly related to an internal exposure of individuals. Internal exposure can only be evaluated by measurement of the substances or their metabolites in human biological materials, such as blood and urine (human biomonitoring). Accordingly, the aim of this thesis was the development of a reliable analytical biomonitoring procedure for the determination of monoterpene metabolites in blood and urine which can be used for the assessment of the human body burden caused by monoterpene exposure, with the focus on R-limonene, α-pinene, and 3-carene. Since there is only little known about the relevant human in vivo metabolites of these substances, several additional studies regarding the human metabolism and the renal background elimination of the metabolites were performed. Due to various analytical obstacles, the development of a reliable, sensitive and selective method for the trace analysis of monoterpene metabolites in human biological matrices was a challenging task. The main issues in this context were the broad spectrum of the target analytes’ physicochemical properties with regard to pKa, volatility, reactivity, and solubility combined with the instability of the monoterpenoid backbone during ionization in the mass spectrometer. Therefore, there was only a limited repertory of selective sample preparation and sensitive instrumental analysis procedures that could have been applied. The analytical hurdles have so far only been taken by using compromise solutions that were unsuitable for extensive metabolism studies. For instance, all monoterpene biomonitoring procedures published up to now exclude multiply functionalized and especially carboxylated metabolites, from the outset. Owing to the lack in appropriate analytical procedures, there was a considerable gap in the knowledge of the human in vivo monoterpene metabolism and the elimination kinetics of the metabolites with regard to different routes of exposure. The biomonitoring procedure developed here, allowed for the first time comprehensive insights into the human secondary metabolism of monoterpenes in vivo. The method was designed for the assessment of altogether twelve oxidized metabolites of R-limonene (cis-carveol, trans-carveol, perillyl alcohol, perillic acid, limonene-1,2-diol, and limonene-8,9-diol), α-pinene (cis-verbenol, trans-verbenol, and myrtenol) as well as 3-carene (3-caren-10-ol, 3-caren-10-carboxylic acid, and 3-caren-3,4-diol). During method development, several theoretical analysis strategies were elaborated and subsequently trialed. Ultimately, reliable trace determination of the target-compounds in human biological matrices was achieved by unspecific but highly concentrating solid-supported liquid-liquid extraction, two-step silylation, and highly selective and sensitive gas chromatographic–tandem-mass spectrometric analysis with positive chemical ionization (GC–PCI-MS/MS). Special attention was directed to the derivatisation of the different functional groups. The aim of derivatisation was stabilization, elevation of the molecular mass, and improvement of the gas chromatographic behavior of the metabolites. The decisive factor and a challenging task was the complete derivatisation of the relatively inert tertiary hydroxyl groups of some analytes (limonene-1,2-diol, limonene-8,9-diol, 3-caren-3,4-diol). After comprehensive testing, the sequential use of two different trimethylsilyl-donators with varying concentrations and re-action strengths finally yielded in completeness of the derivatisation reaction. Thus, in a first step, an excess of concentrated N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1 % trimethylchlorosilane is used for the silylation of reactive functional groups such as primary and secondary alcohols, carboxylic acids, and matrix compounds. This reagent is characterized by high volatility of the reaction by-products and good dissolving properties. In a second step, the remaining unreactive tertiary alcohols are derivatized using small quantities of the potent trimethylsilyl-donor N-(Trimethylsilyl)imidazole (1 %). This consecutive approach was required since the use of concentrated N-(Trimethylsilyl)imidazole would have led to large quantities of semi-volatile and therefore interfering reaction by-products in the gas chromatographic system. The method may be applied to urine as well as to the complex matrix whole-blood, due to its rugged sample preparation procedure. The limits of detection were < 0.3 µg/L and < 0.7 µg/L in urine and blood, respectively. Mean accuracy was determined to be 91 – 104 % in urine and 94 – 106 % in blood. The within day precision of the analysis was < 8 % in urine and < 10 % in blood and the day to day precision was < 18 % in urine and < 10 % in blood, respectively. Thus, the method produces accurate and precise results. Furthermore, a broad spectrum of oxidized metabolites with different functional groups, for instance primary and secondary alcohols, carboxylic acids, and diol-structures, may be analyzed. For quantitation structurally identical or enantiomeric references are used and analytical error compensation is achieved by application of isotope labeled internal standards, in most cases. Following method development, extensive studies on the in vivo monoterpene metabolism were feasible. Thus, four different approaches were pursued. The first study was focused on the background elimination of monoterpene metabolites in urine of 36 occupationally non-exposed individuals. The aim of this approach was to gain insight into the normal, renal background metabolite elimination. Nine out of the eleven analyzed metabolites could be detected in 89 – 100 % of the samples covering a wide concentration range from the limit of detection up to the middle mg/L level. Due to the sensitive analytical procedure, trace levels of renally excreted metabolites could also be detected. Thus, the pri-mary alcohol perillyl alcohol and the secondary alcohols cis- and trans-carveol could be experimentally confirmed as in vivo metabolites of R-limonene. The varying and particularly high excretion levels of some metabolites were explained by the uptake of the precursor substances via nutrition. Despite low detection limits, two metabolites could not be found in the urine samples. One of these substances was (1R,2R,4R)-limonene-1,2-diol whereas its diastereomer (1S,2S,4R)-limonene-1,2-diol was present in 89 % of the samples. This suggests that the human secondary metabolism of R-limonene selectively produces only one of the theoretically possible trans-configured diastereomers of R-limonene-1,2-diol. This was explained by a stereoselective, epoxide hydrolase catalyzed hydrolysis of the R-limonene-1,2-epoxide intermediate—a mechanism hitherto only shown in microorganisms. The second structure which was absent in the urine samples was 3-carene-10-ol, a metabolite hydroxylised at the methyl sidechain of 3-carene and which was expected to occur in the samples due to priorly conducted in vitro studies. At this stage of the research, it remained unclear, whether all subjects were consistently not exposed to 3-carene or whether the parameter is not a relevant metabolite of 3-carene in vivo. However, this question could be solved in the subsequent metabolism study. The following studies had been designed to investigate the in vivo metabolism and the renal excretion kinetics of the metabolites after oral R-limonene, α-pinene, and 3-carene uptake as well as after pulmonary R-limonene uptake. To achieve these objectives, volunteers were exposed orally with defined amounts of the investigated compounds via custom-made capsules or by inhalation using an exposition chamber. Thus, a detailed examination of the elimination kinetics related to the respective route of exposure had been possible. The kinetics after oral exposure revealed that the monoterpenes undergo fast uptake, metabolism, and renal excretion. The blood levels and the urinary metabolite concentrations show synchronous time courses. Following oral uptake, the maximum concentrations of all metabolites were already reached after 1 – 3 h. In blood, the peak metabolite concentrations were low (< 30 µg/L) and unmetabolized monoterpenes were not detectable (< 4 µg/L). Simultaneously, the volunteers reported a characteristic odor of the exhaled breath which indicated an additional elimination via the lungs. In urine, ten- to hundred-fold higher maximum metabolite concentrations were found than in blood. Thus, there must be a quick transfer from blood to urine. This transfer is presumably supported by the high conjugation rate of the metabolites in urine which is on average 83 % (glucuronides or sulfates). After the peak concentrations, the metabolites quickly fall off to their base-levels in both biological matrices. The half-lives of the renal elimination were about 1 – 2 h. Following respiratory uptake, synchronous metabolite elimination kinetics were found as well, however, unmetabolized R-limonene was quantifiable in blood, and the renal elimination half-lives were two to five times longer than after oral uptake. Furthermore, in total nine to date unknown metabolites of α-pinene and 3-carene have been identified and their structures were predicted using mass spectrometric data. All of these additional metabolites were oxidation products of the methyl sidechains of the monoterpenoid backbone. Seven of them were carboxylic acids. The discovery of these structures proved that—independent from the individual structure—the methyl sidechain oxidation plays a more important role in human monoterpene metabolism than the epoxidation of the endo-cyclic double bond or the oxidation of the cyclohexenyl ring. One of these sidechain oxidation products was clearly identified as 3 carene 10 carboxylic acid using a synthetic reference substance. Additionally, its elimination kinetic was revealed in blood and urine. However, its metabolic precursor 3-carene-10-ol could not have been detected in the same samples. These findings could explain the results of the background elimination study (first study), since it became clear that 3-carene-10-ol is apparently not a relevant in vivo excretion product of 3-carene but is only an intermediate product which is rapidly oxidized to the acidic structure. The metabolism studies led to several new findings which on the one hand extended the knowledge about the human monoterpene metabolism in vivo and on the other hand created the basis for future applications of monoterpene biomonitoring:

  • Monoterpenes undergo an extensive presystemic elimination after uptake of acute and low oral doses usually caused by nutrition or by ingestion of phytopharmaceuticals. This elimination behavior could be explained by the hepatic first-pass effect. This means that the majority of the orally absorbed monoterpenes are metabolized during the first passage through the liver, so that only small proportions of unmetabolized compounds reach the systemic bloodstream. Consequently, the metabolites are rapidly eliminated via urine with short half-lives of 1 –2 h. In contrast, the study showed that unmetabolized R-limonene entered the blood following pulmonary uptake, avoiding the hepatic first-pass effect. Renal elimination half-lives after inhalation exposure were two to five times longer, indicating a distribution of the unmetabolized and therefore nonpolar precursor structure in adipose tissues. This knowledge about different renal excretion behaviors depending on the route of exposure is essential for a suitable monoterpene biomonitoring and for the evaluation of measured values.
  • Comparing the renal metabolite patterns of the different studies, one can identify another important point: the oxidation of the methyl sidechains up to the carboxylic acids appears to be a central path in the metabolism of the studied compounds. This means that a majority of metabolites detected in urine possesses at least one carboxylic acid structure at a methyl sidechain. This pathway is quantitatively only topped by the epoxidation of the exo-cyclic double bond which is, however, not present in all monoterpenes. In contrast, the allylic oxidation of the cyclic carbon atoms only plays a minor role. Consequently, one can conclude that the complete oxidation of the methyl sidechains plays a central role in the in vivo metabolism of mono- and bicyclic monoterpenes in general. This finding is essential, since on the one hand this leads to an easy prediction of to date unknown metabolites of other monoterpenes and on the other hand the acidic structures may be straightforwardly analyzed due to their protic properties which may be exploited in future biomonitoring applications. The fourth study investigated for the first time the correlation of monoterpene indoor-air concentrations on an environmental exposure level with the renal metabolite excretion of the exposed persons. For this purpose, a cross-sectional pilot-study was performed in 45 daycare centers of which the R-limonene, α-pinene, and 3-carene indoor-air concentrations were measured throughout a whole day. Additionally, urine samples of 222 children were drawn in the evening after a full-day stay in one of the daycare centers investigated. The urine samples were analyzed as part of the present work. Although the median air concentrations were low (< 10 µg/m³) and clearly below the German health precaution guide values for indoor airborne monoterpenes, renal background elimination of metabolites could be demonstrated. This background elimination was in good agreement with the values found for unexposed adults in the first study. Despite the low air levels, weak statistically significant correlations with most of the renal metabolites were revealed. However, low correlation coefficients and the results of the prior studies indicated that if air concentrations are low, additional oral exposure, probably via nutrition, may play a more important role for the renally excreted amounts of metabolites. In summary, the development of a highly sensitive and selective biomonitoring method provided for the first time the trace-level analysis of a broad spectrum of monoterpene metabolites in blood and urine. Using this method, it was possible to investigate and clarify the human in vivo metabolism of R-limonene, α-pinene, and 3-carene and to reveal the renal elimination kinetics of their metabolites after oral and inhalation exposure, respectively. The four studies performed yielded in the following results of key importance:
  • There is a general background exposure with the monoterpenes R-limonene, α-pinene, and 3-carene which can be identified and quantified in blood and urine using human biomonitoring of the metabolites.
  • In situations of background exposure, renal monoterpene metabolite excretion is obviously mainly characterized by oral monoterpene uptake, probably via nutrition and is homogenous across different study populations.
  • Low oral doses of monoterpenes undergo an extensive presystemic first-pass metabolism which causes rapid elimination of the metabolized substances and prevents from accumulation in adipose tissues. In contrast, pulmonary uptake of monoterpenes may lead to distribution or accumulation in adipose tissues, since their unmetabolized and therefore lipophilic structures become systemically available.
  • Mono- and bicyclic monoterpenes are preferably metabolized to carboxylated structures at methyl sidechains during human in vivo metabolism. The findings gained in this work provide the basis for future studies on the metabolism and the human biomonitoring of monoterpenes and may be used for the prediction of to date unknown metabolites of other monoterpenes.
Abstract

Monoterpene sind biogene flüchtige organische Verbindungen mit strukturabhängig charakteristischen Aromaeigenschaften, die von einer Vielzahl von Pflanzen und Mikroorganismen gebildet werden. Aus diesem Grund ist der Mensch täglich über die Ernährung und die Atemluft gegenüber diesen Substanzen exponiert. Die quantitativ bedeutendste Rolle spielen dabei das in vielen Pflanzen, Lebensmitteln, Kosmetika und Bedarfsgegenständen verbreitete, monocyclische Monoterpen R-Limonen und die beiden für Nadelhölzer typischen, bicyclischen Monoterpene α-Pinen und 3-Caren. Während die Verwendung aliphatischer Monoterpene – zu denen auch die drei zuvor genannten Monoterpene zählen – als Aroma-, Geruchs- und Geschmacksstoffe in Lebensmitteln und somit auch ihre orale Aufnahme durch den Menschen als toxikologisch unbedenklich angesehen werden, wird eine akute und chronische inhalative Exposition, teilweise kritisch bewertet. Insbesondere ihre irritativ-entzündliche Wirkung auf Schleimhäute sowie histologische Veränderungen der Leber und enzyminduzierende Wirkung im Tierversuch werden als adverse Effekte angesehen. Für den beruflichen Kontakt gilt daher in Deutschland eine maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK) von 28 mg R-Limonen/m³ Innenraumluft und für die Allgemeinbevölkerung wurden Gefahrenrichtwerte für die Innenraumluft von 10 mg R-Limonen/m³ und für die Summe aus bicyclischen Monoterpenen von 2 mg/m³ (hauptsächlich α-Pinen und 3-Caren) festgelegt. Expositionen gegenüber Monoterpenen wurden bisher fast ausschließlich mithilfe von Raumluftmessungen erfasst. Diese spiegeln aber nur die äußere Belastung wider und lassen nicht direkt auf eine innere Belastung der exponierten Personen schließen. Innere Belastungen können nur durch Messung eines Fremdstoffs oder seiner Metabolite in humanbiologischem Material (Human-Biomonitoring) erfasst werden. Ziel dieser Arbeit war es, ein geeignetes Human-Biomonitoring-Analysenverfahren für die Bestimmung von Monoterpen-Metaboliten in Blut und Urin zu entwickeln, mit dessen Hilfe die innere Belastung des Menschen zuverlässig erfasst werden kann. Der Fokus wurde dabei auf die drei Monoterpene R Limonen, α-Pinen und 3-Caren gelegt. Da bisher aber Unklarheit über die relevanten in vivo Metabolite der drei Substanzen bestand, sollte in unterschiedlichen Studien der Metabolismus untersucht sowie die renale Hintergrundausscheidung dieser Substanzen geklärt werden. Die Entwicklung einer zuverlässigen, sensitiven und selektiven Spurenanalytik von Monoterpen-Metaboliten in humanbiologischen Matrices stellte aufgrund verschiedener analytisch-chemischer Hindernisse eine Herausforderung dar. Hervorzuheben sind dabei einerseits das breite Spektrum physikalisch-chemischer Eigenschaften der unterschiedlichen Analyten sowie andererseits die Instabilität der monoterpenoiden Grundstruktur bei der Ionisierung im Massenspektrometer. Eine gezielte Probenvorbereitung und sensitive instrumentelle Analytik waren aufgrund dieser Einflussgrößen stark eingeschränkt. Die analytischen Hürden wurden bislang ausschließlich mithilfe von Kompromisslösungen genommen, die für umfassende Metabolismus-Studien ungeeignet waren. So wurden bei allen bisher publizierten Human-Biomonitoring-Methoden mehrfach funktionalisierte und insbesondere carboxylierte Metabolite von vornherein diskriminiert. Folglich bestand aufgrund der fehlenden analytischen Methodik eine erhebliche Lücke im Wissen über den in vivo Metabolismus von Monoterpenen und die Eliminationskinetiken der Metabolite in Bezug auf unterschiedliche Expositionswege. Mit der im Zuge dieser Arbeit entwickelten Biomonitoring-Spurenanalytik wurde erstmals ein Instrument geschaffen, mithilfe dessen ein umfassender Einblick in den in vivo Sekundärstoffwechsel von Monoterpenen möglich ist. Die Biomonitoring-Methode wurde für die Erfassung von insgesamt zwölf oxidierten Metaboliten von R-Limonen (cis-Carveol, trans-Carveol, Perillylalkohol, Perillasäure, Limonen-1,2-diol, Limonen-8,9-diol), α-Pinen (cis-Verbenol, trans-Verbenol, Myrtenol) und 3-Caren (3-Caren-10-ol, 3-Caren-10-carbonsäure, 3-Caren-3,4-diol) entwickelt. In der Entwicklungsphase wurden umfangreiche theoretische Analysestrategien erarbeitet und diese anschließend in der praktischen Anwendung getestet. Eine Kombination aus unspezifischer, aber stark anreichernder Festphasenunterstützter Flüssig-Flüssig Extraktion (SSLLE), zweistufiger Silylierung sowie hochselektiver und -sensitiver Gaschromatographie–Tandem-Massenspektrometrie mit positiv chemischer Ionisierung (GC–PCI-MS/MS) ermöglichte letztlich die zuverlässige Spurenanalyse der Zielverbindungen in den humanbiologischen Matrices. Besonderes Augenmerk wurde bei der Methodenentwicklung auf die Derivatisierung der unterschiedlichen funktionellen Gruppen gelegt. Ziel der Derivatisierung war die Stabilisierung, Molekularmassenerhöhung sowie die Verbesserung der gaschromatographischen Eigenschaften der Metabolite zu erreichen. Die quantitative Umsetzung der reaktionsträgen tertiären Hydroxylgruppen einiger Analytenstrukturen (LMN-1,2-diol, LMN-8,9-diol, 3-Caren-3,4-diol) war dabei ein entscheidender Faktor und eine anspruchsvolle Problemstellung. Nach umfangreichen Tests wurde schließlich, durch den sequentiellen Einsatz von zwei unterschiedlichen Trimethylsilyl-Donatoren mit unterschiedlicher Konzentration und Reaktionsstärke gegenüber tertiären Alkoholen, die vollständige Derivatisierung erreicht. Bei diesem Vorgehen werden in einem ersten Schritt die reaktiven funktionellen Gruppen (primäre, sekundäre Alkohole, Carbonsäuren sowie Matrix-Komponenten) mit einem konzentrierten Überschuss von N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid und 1 % Trimethylchlorsilan silyliert. Dieses Reagenz zeichnet sich durch hohe Flüchtigkeit der Reaktionsnebenprodukte sowie gute Solvatisierungseigenschaften aus. Im zweiten Schritt werden mit geringen Mengen des sehr starken Trimethylsilyl-Donators N-Trimethylsilylimidazol (1 %) die verbleibenden unreaktiven tertiären Alkohole umgesetzt. Der konzentrierte Einsatz dieses starken Silylierungsreagenzes ist aufgrund seiner schwerflüchtigen Reaktionsnebenprodukte in der gaschromatographischen Spurenanalytik nicht praktikabel, daher war ausschließlich der hier entwickelte kombinierte Einsatz zielführend. Aufgrund der robusten Probenaufarbeitung konnte die Methode ohne tiefgreifende Variationen sowohl auf Urin als auch auf die komplexe Matrix Vollblut angewendet werden. Es wurden Nachweisgrenzen von < 0,3 µg/L in Urin und < 0,7 µg/L in Vollblut erreicht. Die Richtigkeit der Bestimmung lag für Urin im Mittel bei 91 – 104 % und für Vollblut bei 94 – 106 %. Die Präzision lag bei < 8 % im Urin und < 10 % in Vollblut in Serie sowie < 18 % in Urin und < 10 % in Vollblut an unterschiedlichen Messtagen. Die Methode produziert somit richtige und präzise Ergebnisse. Insgesamt deckt die Analysemethode ein breites Spektrum möglicher oxidativer Funktionalisierungen der Monoterpene ab. So werden primäre und sekundäre Alkohole, Carbonsäuren sowie aus Monooxygenierung von Doppelbindungen und anschließender Epoxidhydrolyse resultierende Diole erfasst. Zudem werden alle Quantifizierungen mittels strukturidentischer bzw. enantiomerer Referenzsubstanzen und größtenteils auch mit isotopenmarkierten internen Standards durchgeführt. Im Anschluss an die Methodenentwicklung war es möglich gezielt umfassende in vivo Studien zum Metabolismus der drei Monoterpene am Menschen durchzu-führen. Dazu wurden vier unterschiedliche Studienansätze verfolgt. In der ersten Studie wurden die Hintergrundgehalte der Monoterpen-Metabolite im Urin von 36 beruflich nicht belasteten Personen untersucht, um einen Einblick in die renale Normalausscheidung der einzelnen Metabolite zu bekommen. Hier zeigte sich, dass neun von elf untersuchten Metaboliten in 89 – 100 % der Proben nachweisbar waren und diese eine weite Konzentrationsspanne von der Nachweisgrenze bis hin zum mittleren mg/L-Bereich abdeckten. Wegen der sensitiven Analytik konnten neben den deutlichen Hauptmetaboliten auch Metabolite quantifiziert werden, die nur im Spurenbereich ausgeschieden wurden. So konnten erstmals der primäre Alkohol Perillylalkohol und die beiden sekundären Alkohole cis- und trans-Carveol als humane in vivo Metabolite von R Limonen bestätigt werden. Die variablen und teilweise sehr hohen Ausscheidungsmengen einzelner Metabolite werden durch die alimentäre Aufnahme der Monoterpene erklärt. Zwei Analyten waren trotz geringer Nachweisgrenzen in keiner der Proben nachweisbar. Einer dieser Metabolite ist das (1R,2R,4R)-Limonen-1,2-diol, dessen Diastereomer (1S,2S,4R) Limonen-1,2-diol dagegen in 89 % aller Proben nachweisbar war. Dadurch wurde deutlich, dass der humane R-Limonen-Stoffwechsel stereoselektiv nur eines der beiden möglichen trans-konfigurierten Diastereomere von R-Limonen-1,2-diol hervorbringt. Dies kann mit der stereoselektiven, Epoxidhydrolase-katalysierten Hydrolyse des R-Limonen-1,2-epoxids erklärt werden, ein Mechanismus, der bisher nur in Mikroorganismen gezeigt wurde. Der andere in den Urinproben nicht nachweisbare Analyt war der aufgrund von in vitro Studien erwartete, an der Methylseitenkette hydroxylierte 3-Caren Metabolit 3-Caren-10-ol. Unklar war zu diesem Zeitpunkt der Untersuchungen, ob die Probanden durchweg nicht gegenüber 3-Caren exponiert waren oder ob 3-Caren-10-ol kein relevanter 3-Caren-Metabolit ist. Im Verlauf der sich anschließenden Metabolismus-Studien konnte die Abwesenheit von 3-Caren-10-ol erklärt werden. Die beiden folgenden Studien waren dem in vivo Metabolismus und der renalen Ausscheidungskinetik der Metabolite nach oraler R-Limonen, α-Pinen und 3-Caren sowie nach inhalativer R-Limonen Exposition gewidmet. Dazu wurden Probanden mit definierten Mengen der Substanzen oral bzw. inhalativ exponiert. Auf diese Weise war eine detaillierte Analyse der Ausscheidungskinetiken, bezogen auf die unterschiedlichen Aufnahmewege möglich. Die Kinetiken nach oraler Exposition verdeutlichten, dass die Monoterpene schnell aufgenommen, metabolisiert und renal ausgeschieden werden. Die Blutkonzentrationen und die renalen Ausscheidungsmengen der Metabolite zeigten synchrone Verläufe. Die maximalen Konzentrationen aller Metabolite waren bereits 1 – 3 h nach der oralen Applikation erreicht. Im Blut waren diese insgesamt gering (< 30 µg/L) und zudem waren unverstoffwechselte Monoterpene nicht nachweisbar (< 4 µg/L). Im gleichen Zeitraum wurde von den Probanden ein charakteristischer Geruch der Ausatemluft beschrieben, was auf eine zusätzliche Elimination der Ausgangsverbindungen über die Lunge hindeutet. Im Urin zeigten sich rund zehn bis hundertfach höhere maximale Metabolitenkonzentrationen als im Blut. Der Übergang vom Blut in den Urin erfolgt somit offensichtlich schnell. Begünstigt wird dieser Übergang vermutlich durch den hohen Konjugatanteil der Metabolite im Urin von durchschnittlich 83 % (als Glucuronide oder Sulfate). Nach Erreichen des Maximums sanken die Metabolitenkonzentrationen in beiden biologischen Matrices schnell auf das Ausgangsniveau ab. Die Halbwertszeiten der renalen Eliminationen lagen dabei zwischen 1 und 2 h. Nach inhalativer Aufnahme ergaben sich für R-Limonen ähnliche, synchrone Ausscheidungskinetiken der einzelnen Metabolite. Jedoch war unverstoffwechseltes R-Limonen im Blut quantifizierbar und die Halbwertszeiten der renalen Metabolitenausscheidungen waren zwei bis fünfmal länger als nach oraler Aufnahme. Zusätzlich zu den zwölf quantifizierten Metaboliten wurden in den Urinproben der oral Exponierten Probanden insgesamt neun bisher unbekannte Humanmetabolite von α-Pinen und 3-Caren identifiziert und ihre Strukturen mithilfe von massenspektrometrischen Daten abgeleitet. Alle zusätzlich identifizierten Metabolite waren an den Methylseitenketten der monoterpenoiden Grundstruktur oxidiert, sieben davon bis zur Carbonsäure. Mit dem Nachweis dieser Strukturen konnte gezeigt werden, dass die Methylseitenkettenoxidation gegenüber anderen Metabolismuswegen, wie beispielsweise der Epoxidierung der endo-cyclischen Doppelbindung oder der Oxidation des Cyclohexenylrings, strukturübergreifend im humanen Monoterpenstoffwechsel dominiert. Eines dieser Produkte der Sei-tenkenntenoxidation wurde, durch den Vergleich mit einer synthetischen Refe-renzsubstanz, erstmals eindeutig als 3-Caren-10-carbonsäure identifiziert und zusätzlich seine renale Eliminationskinetik beschrieben. Gleichzeitig war erneut in keiner der Proben dieser Studien 3-Caren-10-ol nachweisbar. Mit dem Nach-weis von 3-Caren-10-carbonsäure bei gleichzeitiger Abwesenheit von 3-Caren-10-ol konnten somit auch die Beobachtungen in den Hintergrundproben der ersten Studie erklärt werden. Offenbar ist 3 Caren-10-ol kein relevantes in vivo Ausscheidungsprodukt von 3-Caren, sondern tritt lediglich als kurzlebiges Intermediärprodukt im Stoffwechsel auf. Aus den Metabolismus-Studien wurden mehrere neue Erkenntnisse gewonnen, die einerseits das Wissen über den humanen in vivo Metabolismus erweitern und andererseits wichtige Grundlagen für eine zukünftige Anwendung des Monoterpen-Human-Biomonitoring darstellen:

  • Monoterpene unterliegen nach oraler Aufnahme von geringen Dosen, wie sie bei normaler Aufnahme über die Nahrung oder Phytopharmaka vorkommen, einer umfassenden präsystemischen Elimination, die mit dem hepatischen First-Pass-Effekt erklärt wird. Das bedeutet, dass ein Großteil der oral aufgenommenen Monoterpene bereits während der ersten Leber-Passage metabolisiert wird. Folglich gelangen – wenn überhaupt – nur geringe Mengen der unverstoffwechselten Substanzen in den systemischen Blutkreislauf und die Stoffwechselprodukte werden mit kurzen Halbwertszeiten (1 – 2 h) über den Urin ausgeschieden. Im Gegensatz dazu gelangt R-Limonen nach inhalativer Aufnahme (bei der der hepatische First-Pass-Effekt umgangen wird) unverstoffwechselt ins Blut. Zwei bis fünfmal längere Halbwertszeiten der renalen Ausscheidung zeigen an, dass es von dort aus aufgrund seiner unpolaren Struktur offensichtlich gut in adipösem Gewebe verteilt wird. Das Wissen über diese vom Aufnahmeweg abhängigen Unterschiede im renalen Ausscheidungsverhalten ist essentiell für eine adäquate Anwendung des Monoterpen-Human-Biomonitorings und die Beurteilung der Messwerte.
  • Für alle drei Monoterpene wurde nachgewiesen, dass die vollständige Oxidation der Methylseitenketten bis hin zu den entsprechenden Carbonsäuren einer der wichtigsten Metabolismuswege ist. Das bedeutet, dass ein Großteil der im Urin nachweisbaren Metabolite mindestens an einer Methylseitenkette zur Carbonsäure funktionalisiert wird. Dieser Stoffwechselweg büßt offenbar lediglich an Relevanz ein, wenn die Epoxidierung einer exo-cyclischen Doppelbindung möglich ist. Eine derartige Doppelbindung ist allerdings nicht in allen Monoterpenen vorhanden. Demgegenüber spielt die allylische Oxidation der Ring-C-Atome des C6-Cyclus bei allen Monoterpenen eine untergeordnete Rolle. Die Seitenkettenoxidation stellt somit eine zentrale Reaktion des Monoterpen-Sekundärstoffwechsels in vivo dar, die strukturunabhängig sowohl bei mono- als auch bei bicyclischen Monoterpenen be-vorzugt abläuft. Dieses Ergebnis ist von zentraler Bedeutung. Einerseits können nun auch Metabolite von anderen Monoterpenen, von denen bisher keine Metabolismus-Daten vorliegen, besser vorhergesagt werden. Andererseits sind die Carbonsäuren aufgrund ihrer protischen Eigenschaften analytisch selektiv zu erfassen, was für entsprechende Human-Biomonitoring-Applikationen genutzt werden kann. In der vierten Studie wurde erstmals der Zusammenhang zwischen einer Monoterpen-Innenraumluftbelastung im umweltmedizinischen Konzentrationsbereich und der renalen Metabolitenausscheidung der sich in den Räumen aufhaltenden Personen untersucht. Dazu wurde eine vergleichende Studie in 45 Kindertagesstätten durchgeführt, deren R-Limonen, α-Pinen und 3-Caren Innenraumluftkonzentrationen gemessen wurden. Von 222 Kindern wurden am Tag der Raumluftmessung, nach ganztägigem Aufenthalt in den untersuchten Innenräumen, Urinproben genommen. Die Proben wurden im Rahmen dieser Arbeit auf Monoterpen-Metabolite untersucht. Obwohl die Monoterpen-Innenraumluftbelastungen insgesamt gering waren (Median < 10 µg/m³) und deutlich unter den Vorsorge- bzw. Gefahrenrichtwerten für mono- und bicyclische Monoterpene im Innenraum lagen, konnten Hintergrundausscheidungen der Metabolite im Urin ermittelt werden. Diese stimmten im Wesentlichen mit den in der ersten Studie erfassten Hintergrundausscheidungen von beruflich nicht belasteten, erwachsenen Personen überein. Trotz der geringen Exposition über die Luft wurden, außer für die Verbenole, für alle renal ausgeschiedenen Metabolite schwache, statistisch signifikante Korrelationen mit den Luftkonzentrationen nachgewiesen. Niedrige Korrelationskoeffizienten und die Ergebnisse der vorherigen Studien ließen allerdings darauf schließen, dass bei diesen geringen Luftkonzentrationen die alimentäre Belastung mit Monoterpenen den größeren Einfluss auf die Metaboliten-Konzentrationen im Urin haben dürfte. Zusammenfassend wurde mit der hochsensitiven Human-Biomonitoring-Methode ein Instrument entwickelt, mit dem erstmals Spurenkonzentrationen eines breiten Spektrums von Monoterpen-Metaboliten in Blut und Urin erfasst werden können. Zusätzlich ermöglicht das entwickelte Verfahren die Identifizierung bisher unbekannter Metabolite. Mithilfe dieser Analytik war es möglich, den menschlichen in vivo Metabolismus von α-Pinen, 3-Caren und R-Limonen umfassend aufzuklären und die Ausscheidungskinetiken ihrer Metabolite nach peroraler bzw. inhalativer Aufnahme zu dokumentieren. Die vier durchgeführten Humanstudien brachten dabei die folgenden zentralen Erkenntnisse hervor:
  • Es besteht eine allgemeine Hintergrundbelastung gegenüber den Monoterpenen R-Limonen, α-Pinen und 3-Caren, die mittels Human-Biomonitoring der Metabolite in Blut und Urin erfasst werden kann.
  • Bei Hintergrundbelastung ist die Ausscheidung von Monoterpen-Metaboliten im Wesentlichen durch alimentär aufgenommene Monoterpene geprägt und ist, unabhängig vom untersuchten Kollektiv, sehr homogen.
  • Werden Monoterpene oral in geringen Mengen aufgenommen, unterliegen sie einem umfangreichen präsystemischen First-Pass-Effekt, der zu einer schnellen Elimination der Substanzen bzw. ihrer Metabolite führt und eine Akkumulation im Fettgewebe verhindert. Werden Monoterpene dagegen inhalativ aufgenommen, sind sie zum Teil in ihrer unveränderten, lipophilen Form systemisch verfügbar und können somit auch in adipösem Gewebe verteilt bzw. gespeichert werden.
  • In vivo werden mono- und bicyclische Monoterpene beim Menschen strukturübergreifend verstärkt zu den an den Methyl-Seitenketten carboxylierten Metaboliten abgebaut. Die hier gewonnenen Erkenntnisse liefern somit eine breite Basis für zukünftige Studien zum Metabolismus und Human-Biomonitoring von Monoterpenen und können zudem für die Vorhersage von Human-Metaboliten anderer Monoterpene verwendet werden.
DOI
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