The Influence of Matrix Properties on Cell Migration in Disordered 3-dimensional Biopolymer Network
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Cell migration through 3-dimensional matrices is involved in numerous biological
processes, ranging from embryogenesis to wound repair and the progression of
metastases. In contrast to flat 2D surfaces, cells in a 3D environment, for example a
biopolymer network, are surrounded by matrix material. The properties of the matrix
material like pore size or stiffness are suspected to impact the behavior of embedded
cells. Knowing these properties is therefore of crucial importance. To evaluate the pore
size of such biopolymer networks, confocal reflectance microscopy is a widely used
method. However, it fails to resolve vertical fibers and produces directionally biased
images of the networks. Moreover, for porous 3D networks such as collagen, it is
difficult to separate the effect of matrix stiffness on cell migration from effects of
matrix pore size and adhesive ligand density, and is therefore unknown.
This work demonstrates how the properties of extracellular matrices can be evaluated
and the effects of matrix stiffness and pore size on cell migration can be separated. To
estimate the true 3D pore size from directionally biased data sets, we first determine the
distribution of distances from random points in the fluid phase to the nearest fiber. This
distribution follows a Rayleigh distribution, regardless of isotropy and data bias, and is
fully described by a single parameter - the characteristic pore size of the network. The
bias of the pore size estimate due to the missing fibers can be corrected by
multiplication with the square root of the visible network fraction. We experimentally
verify the validity of this approach by comparison with data obtained using confocal
fluorescence microscopy, which represents the full structure of the network.
To separate the effects of matrix stiffness and pore size on cell migration, we used
glutaraldehyde as a cross-linker to increase the stiffness of self-assembled collagen
biopolymer networks independently of collagen concentration or pore size. Cell
migration in gels with pore sizes larger than 5 µm increased with higher gel stiffness,
whereas migration in gels with smaller pores decreased with higher gel stiffness. These
data show that 3D cell migration is enhanced by higher matrix stiffness, opposite to cell
behavior in 2D, as long as the pore size does not fall below a critical value where it
causes excessive steric hindrance.
In addition, we show the complex dependence of cell migration from different cell
types, all originated in breast tissue, on matrix properties like stiffness, pore size and
matrix composition. Finally we show that the human amnion can be used as a natural
substitute material to study cell migration.
These findings may be important for optimizing the recellularization of soft tissue implants or for the design of 3D invasion models in cancer research.
Abstract
Migrierende Zellen sind an allen Prozessen des Lebens beteiligt: von der Embryogenese
über die Wundheilung bis hin zu Metastasenbildung während einer Krebserkrankung.
Im Gegensatz zu flachen, 2-dimensionalen Substraten sind Zellen während ihrer
Migration durch ein 3-dimensionales Biopolymernetzwerk von Matrix umgeben. Dabei
wird vermutet, dass die Eigenschaften der Matrix, wie zum Beispiel deren Porengröße
oder Steifigkeit, das Zellverhalten beeinflussen. Diese Eigenschaften zu kennen ist
daher von großer Wichtigkeit. Eine weit verbreitete Methode die Porengrößen dieser
Netzwerke zu bestimmen, ist die Verwendung von konfokaler Reflexionsmikroskopie.
Allerdings werden bei dieser Methode unvollständige Datensätze erzeugt, da keine
senkrechten Fasern aufgelöst werden können. In porösen 3-D Biopolymernetzwerken
wie Kollagen ist es zudem schwierig, den Einfluss von Matrixsteifigkeit auf die
Zellmigration unabhängig vom Einfluss der Porengrößen und der adhesiven Liganden
zu betrachten.
Diese Promotionsarbeit zeigt, wie die Eigenschaften von extrazellulärer Matritzen
bestimmt und die Einflüsse von Matrixsteifigkeit und Porengröße unabhängig
voneinander betrachtet werden können. Um die korrekte 3-dimensionale Porengröße
aus unvollständigen Daten zu berechnen, werden zunächst die Distanzverteilungen
zufälliger Punkte der Porenzwischenräume zur nächstgelegenen Faser bestimmt. Diese
Verteilung folgt einer Rayleigh Verteilung (unabhängig davon, ob das Netzwerk isotrop
ist oder nicht), welche durch einen einzigen freien Parameter bestimmt wird - die
charakteristische Porengröße des Netzwerkes. Aufgrund der fehlenden Fasern in der
Reflexionsmikroskopie, kommt es zu einem Fehler bei der Abschätzung der Porengröße
der Netzwerke, der aber durch Multiplikation mit dem, in dieser Arbeit berechneten,
Korrekturfaktor ausgeglichen werden kann. Wir bestätigen dieses Vorgehen
experimentell durch einen Vergleich mit Daten aus der Fluoreszenzmikroskopie, welche
die komplette Netzwerkstruktur widerspiegeln.
Um die Einflüsse der Matrixsteifigkeit auf die Zellmigration von denen der
Porengröße zu trennen, verwenden wir Glutaraldehyd als Vernetzer, der die
Gelsteifigkeit erhöht, ohne gleichzeitig die Porengröße zu verändern. Die Invasivität der
Zellen nahm in Gelen mit Porengrößen über 5 µm zu, wenn die Gelsteifigkeit erhöht
wurde. Im Gegensatz dazu sank die Invasivität der Zellen in Gelen mit kleineren Poren,
wenn die Gelsteifigkeit erhöht wurde. Diese Daten zeigen, dass 3-D Zellmigration von
höherer Gelsteifigkeit begünstigt wird, im Gegensatz zur Zellmigration in 2-D, solange XII ZUSAMMENFASSUNG
die Porengröße nicht unter einen kritischen Wert fällt, ab dem sie eine übermäßige
sterische Behinderung darstellt.
Darüber hinaus wird in dieser Arbeit der komplexe Zusammenhang der Migration
verschiedener Zelltypen aus dem gleichen Ursprungsgewebe in verschiedenen
Matrixmaterialien gezeigt. Schließlich wird gezeigt, dass das humane Amnion als
komplett natürliches Ersatzmaterial für das Erforschen von Zellmigration in der
Zellkultur verwendet werden kann.
Diese Erkenntnisse können bei der Optimierung der Neubesiedelung von
Weichteilimplantaten oder der Entwicklung eines Modelles der Tumor- und
Metastasenbildung in der Krebsforschung helfen und in der Zukunft eine große Rolle
spielen.