Interaction of Corynebacterium diphtheriae with host cells

Language
en
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2012-12-28
Issue Year
2012
Authors
Ott, Lisa
Editor
Abstract

Corynebacterium diphtheriae, the causative agent of respiratory diphtheria was generally considered as an extracellular colonizer, with the diphtheria toxin as the main virulence factor. But non-toxigenic strains are also able to adhere to the host cell and to internalize into it. To date, not much is known about the factors, which are crucial for colonization of the host. In the framework of this study, the characterization of the interaction of C. diphtheriae with host cells revealed strain-specific differences in adhesion and invasion rates of seven wild type strains and that adhesion and invasion are not strictly coupled processes. Atomic force microscopic analysis showed that the studied strains differ significantly in their macromolecular surface structure, especially in pili formation and length and number of pili structures (Ott et al, 2010b). Additionally, these pili structures show different biophysical properties which were investigated in collaboration with Reinlaender and co-workers (Rheinlaender et al, 2012). Interestingly, there is no correlation between pili formation, adhesion and invasion of the different wild type strains. Furthermore, we were able to show that one of the three known pili cluster (spaDEF) for C. diphtheriae is absent in the strains investigated. The work proved that there must be other factors which are crucial for colonization if the host besides pili (Ott et al, 2010b). To investigate the invasion process at a more molecular level, we generated insertion mutants in gene DIP1281, whose gene product was annotated as an invasion-associated protein. The resulting mutant strains were not able to separate the daughter cells after cell division, to adhere to the host cell or to invade the cell. Further investigations of the mutants demonstrated that this phenotype is an effect of rearrangements of the outer surface of bacteria, and DIP1281 seems to be predominantly involved in the organization of the outer surface protein layer (Ott et al, 2010a). For further identification of virulence factors, we established an invertebrate infection model for pathogenic corynebacteria for high throughput screening of mutant strains. The nematode Caenorhabditis elegans gives differentiated results with regard to colonization of the host, while the wax moth larvae Galleria mellonella will be useful with respect to innate immune responses to pathogens because it offers a more complex cell-based immune system compared to C. elegans (Ott et al, 2012a). When we studied the host immune response during infection with C. diphtheriae we were able to show that C. diphtheriae is capable of activating the NFĸB transduction pathway in eukaryotic cells in a strain-specific manner; induction only occurs during incubation with living bacteria and requires invasion of the bacteria into the epithelial cells (Ott et al, 2012b). In cooperation with Ochrombel and co-workers, we investigated potassium uptake systems in corynebacteria (Ochrombel et al, 2011) and found that pathogenic corynebacteria, such as C. diphtheriae and C. jeikeium, exhibit more potassium transporters than non-pathogens, such as C. glutamicum. Furthermore, C. diphtheriae K+ transporter mutants were eliminated faster by macrophages and are less stress-resistant, which make K+ uptake systems of pathogenic corynebacteria potential virulence factors with regard to survival in an acid environment, like the inside of macrophages. In collaboration with Trost and co-workers, we participated in data evaluation of the genome sequence of C. pseudotuberculosis FRC41 with the idea of a comparative analysis of pathogenic corynebacteria. This led to the identification of an extended number of virulence factors, indicating that the human isolate C. pseudotuberculosis FRC41 is equipped with a distinct gene set promoting its survival under unfavorable environmental conditions (Trost et al, 2010b).

Abstract

Als Hauptvirulenzfaktor des Gram-positiven, aeroben Bakteriums Corynebacterium diphtheriae wurde bisher das hochwirksame Diphtherietoxin betrachtet. Doch auch nicht-toxigene Stämme sind in der Lage, sich an Wirtszellen anzuheften, in diese einzudringen und sie zu schädigen. Über die Virulenzfaktoren, die dafür verantwortlich sind, ist noch wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion von C. diphtheriae mit eukaryotischen Zellen näher charakterisiert. Adhäsions- und Invasionsanalysen von sieben verschiedenen Wildtypstämmen an Epithelzellen ergaben, dass Adhäsion und Invasion keine strikt gekoppelten Prozesse darstellen. Atomic force mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass sich die Stämme stark in der makromolekularen Oberflächenstruktur, hinsichtlich der Ausbildung und Länge von Pili-Strukturen, voneinander unterscheiden (Ott et al, 2010b). Diese Pili-Strukturen haben außerdem verschiedene biophysikalische Eigenschaften, was durch Arbeiten in Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Rheinlaender gezeigt werden konnte (Rheinlaender et al, 2012). Interessanterweise konnte keine Korrelation zwischen Pili-Formation, Adhäsion und Invasion gefunden werden. Es konnte auch gezeigt werden, dass den untersuchten Stämmen eines von drei für C. diphtheriae bekannten Pili-Clustern (spaDEF), wider Erwarten, fehlt. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass es weitere Faktoren neben den Pili geben muss, die für Adhäsion an Wirtszellen verantwortlich sind (Ott et al, 2010b). Um die Invasion auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurden Insertionsmutanten im Gen DIP1281 hergestellt, dessen Genprodukt als ein Invasions-assoziiertes Protein annotiert ist. Die daraus resultierenden Mutanten waren nicht mehr in der Lage, sich nach der Zellteilung von einander zu separieren, an Wirtszellen anzuheften oder in diese zu invadieren. Weiterführende Studien der Mutanten zeigten, dass dieser Phänotyp auf eine Umgestaltung der Oberfläche der Bakterien zurückzuführen ist. DIP1281 scheint daher vorwiegend in die Organisation der äußeren Proteinschicht involviert zu sein (Ott et al, 2010a). Für zukünftige Arbeiten konnte ein Infektionsmodell für pathogene Corynebakterien etabliert werden, welches ermöglicht Mutanten-Banken von C. diphtheriae in großem Maßstab hinsichtlich der Virulenz zu testen. Dabei erhält man mittels Infektion des Nematoden Caenorhabditis elegans detaillierte Ergebnisse bezüglich der Wirtskolonisation von C. diphtheriae, während die Wachsmottenlarve Galleria mellonella hilfreich bei der Aufklärung der Immunantwort gegenüber Pathogenen ist, da sie über ein komplexeres Immunsystem verfügt als C. elegans (Ott et al, 2012a). Außerdem konnte gezeigt werden, dass C. diphtheriae den NFĸB-Signalweg in HeLa-Zellen auslösen kann und dass dafür die Invasion der Bakterien notwendig ist. Die bloße Adhäsion der Bakterien an die Wirtszellen führte zu keiner intrazellulären Wirtsantwort (Ott et al, 2012b). In Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Ochrombel wurden unterschiedliche Kalium-Aufnahmesysteme in Corynebakterien untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass pathogene Corynebakterien wie C. diphtheriae und C. jeikeium über mehr Kaliumtransporter verfügen als nicht-pathogene. Außerdem werden K+-Transportermutanten von C. glutamicum und C. diphtheriae schneller von Makrophagen eliminiert und sind weniger Stress-resistent (Ochrombel et al, 2011; Ott, unveröffentlicht). Für eine vergleichende Analyse pathogener Corynebakterien, habe ich mich in einem weiteren Kooperationsprojekt an der Datenauswertung der Genom-Entschlüsselung des humanen Isolats Corynebacterium pseudotuberculosis FRC41 maßgeblich beteiligt. Dies führte zur Identifikation einer großen Anzahl von Virulenzfaktoren, die zeigen, dass C. pseudotuberculosis mit einem enormen Genset ausgestattet ist, welches sein Überleben in einer nachteiligen Umgebung sichert (Trost et al, 2010b).

DOI
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