Studien zur Funktion von Ionenkanälen der CNG-Familie für die Ca2+-Homöostase in wachsenden Wurzelhaaren und deren Regulation durch Calmoduline

Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2022-10-04
Issue Year
2022
Authors
Studtrucker, Tanja
Editor
Abstract

The tip-focused oscillating calcium gradient is essential for polar growth of pollen tubes and root hairs. Based on preliminary work (Dissertation C. Brost, 2017), the importance of the three channels AtCNGC6, AtCNGC9, and AtCNGC14 from the CNG (Cyclic Nucleotide Gated) channel family for Ca2+ oscillations in polar growth of root hairs from Arabidopsis thaliana was investigated in this study. Loss of these channels perturbs the integrity of growing root hairs, as a consequence of defective Ca2+ homeostasis. In the present work, CNGC14 was shown to play a special role among the three channels expressed in root hairs, as its loss was associated with the strongest morphological phenotype resulting in the greatest proportion of burst root hairs. Root hairs of the CNGC14 single knock out mutant also burst earlier compared to root hairs of the other two single knock out mutants, suggesting that this channel is either active at an earlier stage during the elongation phase or its absence can be compensated for only at a low extent. Analysis of calcium oscillations in growing root hairs of single and double CNGC knock out mutants demonstrated that the absence of CNGC14 was always accompanied by a loss of the mean oscillation frequency, which is typically 2-4 peaks per minute at the tip of growing root hair cells. This highlights the central role of this channel in maintenance of the oscillatory calcium gradient. The other two channels, CNGC6 and CNGC9 play a stabilizing role in maintaining of the tip-focused calcium gradient in growing root hairs, as their loss resulted in more irregular Ca2+ oscillations in the single knock out mutants, but the typical mean oscillation frequency was unaffected. Calcium influx across the plasma membrane and cytosolic calcium concentration are tightly regulated, thus the channel activity itself is supposed to be regulated as well. At the beginning of this work, little was known about the molecular function and regulation of plant CNG channels, due to the limited functional expression of these channels in heterologous expression systems. Since heterologous systems might lack potential important regulators, this work examined the regulation of some CNG channels by calmodulin (CaM) in Xenopus oocytes. Previous studies have already demonstrated, that Arabidopsis CNGCs interact with calmodulins through their C-terminal domains. Calmodulins and CaM-like proteins constitute regulators of the Ca2+-signaling system and can control the activity of their target proteins, which include ion channels, as function of the intracellular calcium concentration. Present work demonstrates that some CNG channels, such as CNGC12 from Arabidopsis thaliana or AtCNGC14, an essential channel for Arabidopsis root hair growth, as well as the CNG channel from Lotus japoicus LjCNGC1, which is homologous to AtCNGC20 are positively regulated by the C-terminal interaction with CaM2. Thus, the functional expression of channels hitherto not active in heterologous systems was successful and CaM emerged as a positive regulator. The three investigated channels varied in their CaM binding properties in the yeast two-hybrid (YTH) system and regulation by the different CaM isoforms in oocytes. While a previous YTH study did not show any interaction between the 20 CNG channels and CML8 or CML9 from Arabidopsis in yeast, this work showed in a functional analysis that CML9 co-localized with AtCNGC14 in oocytes and negatively regulated its activity, whereas the other two channels AtCNGC12 and LjCNGC1 did not constitute a CML9 target protein. Further differences between the channels studied here involved calcium-dependent interaction with as well as regulation by CaM2. Interaction with apoCaM2 (CaM2E1-4A) was demonstrated for all three channels (LjCNGC1 or LjCNGC1-Brush, AtCNGC12, AtCNGC14) in the yeast system. The loss of calcium binding by the two EF hands of CaM2 that are localized in the C-terminal domain (CaM2E3,4A) resulted in a significantly greater reduction of interaction strength with the C-terminal region of AtCNGC12 and AtCNGC14, respectively, compared to LjCNGC1(-Brush). Experiments using the two-electrode voltage clamp (TEVC) revealed further differences in CaM regulation among the individual channels. While the transport capacity of LjCNGC1(-Brush) was increased by both apoCaM2 and Ca2+/CaM2, with apoCaM2 exerting the strongest effect, no significant difference in channel activity was observed for CNGC12 in the presence of apoCaM2 or Ca2+/CaM2. In contrast, the transport capacity of CNGC14 was enhanced only in presence of Ca2+/CaM2. Thus, CNGC14 constitute apparently a conductance that is positively regulated by calcium, at least in the oocyte system. Using the results obtained in this work and including recent literature, a model for the regulation of CNGC14-mediated Ca2+ influx in growing root hairs was proposed. In this model, CNGC14 forms a channel subunit associated with apoCaM2 that is positively regulated in a calcium-dependent manner and constitutes a feed forward mechanism together with the NADPH oxidase, which functions in maintaining of cell wall properties and root hair growth has been established in former studies. The IQ motif localized in the C-terminal domain plays an important role for the activity and the localization of the channels studied in present work. Point mutations within this sequence disrupted the transport activity of AtCNGC14 as well as LjCNGC1-Brush after heterologous expression in oocytes. The presence of CaM2 did not restore the transport activity of the mutated channel in case of CNGC14 or recovered the transport activity only to a very low extend in case of LjCNGC1-Brush. This loss of activity may result from an impaired surface expression, as the CNGC14 IQ-mutant, unlike the wild type, did not localize to the plasma membrane after co-expression with CaM2 in plant cells. Thus, the IQ domain represents an essential domain, which has either a structural significance or a regulatory function for channel activity.

Abstract

Der spitzenorientierte oszillierende Calciumgradient ist für das polare Wachstum von Pollenschläuchen und Wurzelhaaren essentiell. Basierend auf Vorarbeiten (Dissertation C. Brost, 2017) wurde die Bedeutung der drei Kanäle AtCNGC6, ATCNGC9 und AtCNGC14 aus der CNG (Cyclic Nucleotide Gated)-Kanalfamilie für die Ca2+-Oszillationen in und das polare Wachstum von Wurzelhaaren in Arabidopsis thaliana analysiert. Der Verlust dieser Kanäle stört die Integrität wachsender Wurzelhaare, als Folge einer defekten Ca2+-Homöostase. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass CNGC14 von den drei in Wurzelhaaren exprimierten Kanälen eine besondere Rolle zukommt, da sein Verlust den stärksten morphologischen Phänotyp mit dem größten Anteil an geplatzten Wurzelhaaren einherging. Die Wurzelhaare der CNGC14 Einzelverlustmutante platzten außerdem zu einem früheren Zeitpunkt, verglichen mit den Wurzelhaaren der beiden anderen Einzelverlustmutanten, was daraufhin deutet, dass dieser Kanal entweder zu einem früheren Zeitpunkt in der Elongationsphase aktiv ist oder seine Abwesenheit nur zu einem geringen Grad kompensiert werden kann. Untersuchungen der Calcium Oszillationen in den wachsenden Wurzelhaaren von Einzel- und Doppel CNGC Verlustmutanten ergaben, dass die Abwesenheit von CNGC14 stets mit einem Verlust der mittleren Oszillationsfrequenz einher ging, die typischerweise 2-4 Peaks pro Minute in der Spitze des wachsenden Wurzelhaars aufweist. Dies unterstreicht die zentrale Rolle dieses Kanals in der Aufrechterhaltung des oszillierenden Calciumgradienten. Die beiden anderen Kanäle, CNGC6 und CNGC9 spielen eine stabilisierende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Calciumgradienten in wachsenden Wurzelhaaren, da ihr Verlust zwar zu unregelmäßigeren Ca2+-Oszillationen in den Einzelverlustmutanten führte, jedoch die typische mittlere Oszillationsfrequenz erhalten blieb. Der Einstrom von Calcium über die Plasmamembran sowie die zytosolische Calcium Konzentration werden streng reguliert, was demnach auch für die Kanalaktivität selbst angenommen werden kann. Zu Beginn dieser Arbeit war über die molekulare Funktion und Regulation der pflanzlichen CNG Kanäle nur wenig bekannt, da sich diese Kanäle in heterologen Expressionssystemen nur bedingt funktionell exprimieren ließen. Da in heterologen Systemen mögliche wichtige Regulatoren fehlen könnten, wurde in dieser Arbeit die Regulation einiger CNG Kanäle durch Calmodulin (CaM) in Xenopus Oozyten untersucht. Dass CNGCs über ihren C-terminalen Bereich mit Calmodulinen interagieren, war bereits aus früheren Studien bekannt. Calmoduline und CaM-ähnliche (CML) Proteine gehören zu den Regulatoren des Ca2+-Signalsystems und können durch Interaktion mit ihren Zielproteinen, zu denen auch Ionenkanäle gehören, in Abhängigkeit der intrazellulären Calcium-Konzentration ihre Aktivität steuern. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass einige CNG Kanäle, wie die aus Arabidopsis stammenden Kanäle CNGC12 und der für das Wurzelhaarwachstum wichtige Kanal CNGC14, sowie ein zu AtCNGC20 homologer CNG Kanal aus Lotus japonicus, LjCNGC1, durch ihre C-terminale Interaktion mit CaM2 positiv reguliert werden. Damit war die funktionelle Expression von bis dato in heterologen Systemen nicht aktiven Kanälen gelungen und CaM stellte sich entgegen den Erwartungen als ein Positivregulator heraus. Die drei untersuchten Kanäle unterschieden sich hinsichtlich ihrer CaM Bindeeigenschaften im Hefe-Zwei-Hybrid-System (Yeast Two Hybrid, YTH) sowie der Regulation durch die unterschiedlichen CaM Isoformen in Oozyten. Während eine frühere YTH-Studie keine Interaktion zwischen den 20 aus Arabidopsis stammenden CNG Kanälen und CML8 oder CML9 in Hefe nachwies, konnte in dieser Arbeit in einer funktionellen Analyse gezeigt werden, dass CML9 in Oozyten mit AtCNGC14 ko-lokalisierte und dessen Aktivität negativ regulierte, während die beiden anderen Kanäle AtCNGC12 und LjCNGC1 kein CML9-Zielprotein darstellten. Weitere Unterschiede zwischen den hier untersuchten Kanälen betrafen die Calcium-abhängige Interaktion mit sowie Regulation durch CaM2. Die Interaktion mit apoCaM2 (CaM2E1-4A) konnte für alle drei Kanäle (LjCNGC1 bzw. LjCNGC1-Brush, AtCNGC12, AtCNGC14) im Hefe System dargestellt werden. Der Verlust der Calcium-Bindung durch die beiden in der C-terminalen Domäne lokalisierten EF-Hände von CaM2 (CaM2E3,4A) führte zu einer deutlich stärkeren Reduktion der Interaktionsstärke mit dem C-terminalen Bereich von AtCNGC12 bzw. AtCNGC14 im Vergleich zu LjCNGC1(-Brush). Experimente unter Verwendung der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) enthüllten weitere Unterschiede der CaM-Regulation zwischen den einzelnen Kanälen. Während die Transportkapazität von LjCNGC1(-Brush) sowohl durch apoCaM2 als auch durch Ca2+/CaM2 erhöht wurde, wobei apoCaM2 den stärkeren Effekt ausübte, wurde für CNGC12 kein signifikanter Unterschied der Kanalaktivität in Gegenwart von apoCaM2 oder Ca2+/CaM2 beobachtet. Die Transportkapazität von CNGC14 wurde dagegen nur durch die Gegenwart von Ca2+/CaM2 verstärkt. Somit scheint es sich bei CNGC14 um eine Leitfähigkeit zu handeln, die zumindest im Oozyten-System durch Calcium positiv verstärkt wird. Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen wurde unter Einbeziehung aktueller Literatur ein Modell zur Regulation des CNGC14-vermittelten Ca2+-Influx in wachsenden Wurzelhaaren vorgeschlagen. Dabei bildet CNGC14 eine mit apoCaM2 assoziierte Kanal-Untereinheit, die Calcium-abhängig positiv reguliert wird und zusammen mit der NADPH Oxidase, deren Funktion für die Zellwandeigenschaften und das Wurzelhaarwachstum in anderen Studien etabliert wurde, einen feed forward Mechanismus darstellt. Das in der C-terminalen Domäne lokalisierte IQ-Motiv spielt eine wichtige Rolle für die Aktivität sowie die Lokalisation der in dieser Arbeit untersuchten Kanäle. Das Einführen von Mutationen in diese Sequenz unterband die Transportaktivität von AtCNGC14 sowie LjCNGC1-Brush nach heterologer Expression in Oozyten. In Gegenwart von CaM2 konnte diese nicht, wie im Falle von AtCNGC14 oder nur zu einem geringen Grad, wie für LjCNGC1-Brush beobachtet, wieder hergestellt werden. Möglicherweise ist dies auf eine gestörte Oberflächenexpression zurückzuführen, da die CNGC14 IQ-Mutante im Gegensatz zum Wildtyp nach Koexpression mit CaM2 in Pflanzenzellen nicht an der Plasmamembran lokalisierte. Somit stellt die IQ-Domäne eine essentielle Domäne dar, welcher entweder eine strukturelle Bedeutung oder eine regulatorische Funktion für die Kanalaktivität zukommt.

DOI
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