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Lipasen sind esterolytische Enzyme, welche vorzugsweise an Lipid/Wasser Phasengrenzen aktiv sind. Von großer Bedeutung sind diese Biokatalysatoren bei etablierten industriellen Prozessen, wie z.B. in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie sowie der Herstellung von Detergenzien oder als Additiv in Waschmitteln. Neue Anwendungsgebiete, wie die Produktion von Feinchemikalien für die Pharma- und Agrarindustrie sowie die Herstellung von Biodiesel stellen Herausforderungen dar. Gerade in den letztgenannten Industriezweigen werden herkömmlichen chemischen Verfahren bevorzugt, da die Herstellungskosten von Enzymen einen großtechnischen Einsatz behindern. Um die Kosten für den Einsatz des Biokatalysators zu minimieren, wurden drei Ansatzpunkte bearbeitet.
Bei der Produktion von Lipasen oder anderen Enzymen durch Mikroorganismen fallen Investitions- und Betriebskosten an. Investitionskosten werden maßgeblich vom Reaktordesign und dessen Größe bestimmt, wobei die Betriebskosten zum Beispiel durch den hohen Einsatz von Energie und Zeit bei der Sterilisation sowie teuren Medienbestandteilen festgesetzt werden. Aus dieser Betrachtung heraus wurde in vorhergehenden Arbeiten ein selektives Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik entwickelt, bei dem die Kosten für die Sterilisation entfallen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Maßstabsvergrößerung auf ein Volumen von 350 l durchgeführt. Die robuste Selektivität des Kultivierungssystems im 100-l- und 350-l-Maßstab wurde in 13 individuellen Läufen über einen Kultivierungszeitraum von acht bis zwölf Tagen mit dem Kompostisolat Phialemonium curvatum AW02 gezeigt. Der Mikroorganismus P. curvatum AW02 sowie dessen extrazelluläre Lipasen wurden partiell charakterisiert. Es zeigte sich, dass P. curvatum AW02 mindestens eine zellwandgebundenen Lipase sekretiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das selektive Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik das alleinige Wachstum weiterer bekannter Mikroorganismen, wie z.B. Aspergillus niger, Botrytis cinerea oder Yarrowia lipolytica begünstigt.
Der zweite Ansatzpunkt zur Kostenminimierung ist die Wiederverwendung sowie Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung, was intensive Entwicklungsarbeit voraussetzt. So wurde ein in der Handhabung leicht durchführbares Immobilisierungsverfahren entwickelt, das auf der Einbettung wasserfreier Enzympräparate in ein Polymer-Harz basiert. Dieses Enzym-Polymerharz-Gemisch kann auf Oberflächen mit unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften aufgebracht werden. Als Modellenzym wurde die robuste, Co-Faktor unabhängige, monomere Thermomyces lanuginosus Lipase (TLL) genutzt. Die Immobilisierung mittels wasserfreiem Einbettungsverfahren konnte erfolgreich mit Aktivitäten von bis zu 250 mU/cm² beschichteter Oberfläche gegenüber p- Nitrophenyl-Palmitat (pNPPalm) nachgewiesen werden. Die Co-Faktor-abhängige und unter nativen Bedingungen als Homotetramer vorliegende Threonin Aldolase aus Ashbya gossypii wurde als zweites Beispielenzym erfolgreich mit dem wasserfreien Einbettungsverfahren immobilisiert. Somit konnte gezeigt werden, dass das neuartige wasserfreie Einbettungsverfahren auf verschiedene Enzyme mit unterschiedlicher Komplexität anwendbar ist.
Der dritte Ansatzpunkt ist die Entwicklung eines quantitativen Mikrotiter-Lipase-Nachweissystems. Verschiedene labor- und zeitintensive Verfahren weisen lipolytische Aktivität nach. Um ein schnelles und einfaches Lipase-Nachweissystem zu etablieren, wurde ein turbidimetrisches Lipase-Nachweissystem im Mikroliter-Maßstab, basierend auf einer stabilisierten 1 % (v/v) Tributyrinemulsion entwickelt. Durch die Hydrolyse des Tributyrins kommt es zu einer kontinuierlichen Klärung. Das Auftragen variabler Mengen des Modellenzyms TLL zeigte eine direkte Abhängigkeit zwischen Lipasekonzentration und Abnahme der Extinktion bei 595 nm. Eine eingehende Charakterisierung ergab, dass ein Substratüberschuss bei 1 % (v/v) Tributyrin vorliegt. Somit kann das turbidimetrische Mikrotiter-Lipase-Nachweissystem zur Quantifizierung lipolytischer Proben eingesetzt werden.
Jeder der drei Ansatzpunkte trägt das Potential, robust und einfach, unter kostenminimierten Bedingungen Enzyme herzustellen, sie zu immobilisieren sowie lipolytische Aktivität zu quantifizieren. Daraus ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten aber auch interessante wissenschaftliche Perspektiven.
Um die technische Nutzung und die Vergleichbarkeit der grenzflächenaktivierten Lipase aus dem Mikroorganismus Thermomyces lanuginosus zu verbessern, sollten die kinetischen Parameter unter Berücksichtigung der Größe der reaktiven Grenzfläche und der Stofftransportvorgänge in Grenzflächennähe ermittelt werden. Da bisher keine Versuchsanordnung die Möglichkeit zur parallelen Reaktionsuntersuchung und zur Strömungsuntersuchung von Flüssig-Flüssigphasenreaktionen bot, wurde der Horizontal-Laminar-Fluss-Reaktor (HLFR) entwickelt und wesentliche Aspekte der Entwicklung eingehend beschrieben. Die Innovation des Reaktors bestand darin, dass eine kontinuierliche parallele Strömung zweier nicht mischbarer fluider Phasen ermöglicht wurde. An einer gemeinsamen Phasengrenzfläche mit einer konstanten Grenzflächengröße konnte die enzymatische Umsetzung stattfinden. Um den HLFR für eine kinetische Untersuchung anzuwenden, wurde das Mischungsverhalten mithilfe von Verweilzeitverteilungskurven aufgenommen und die Versuchsanordnung als Reaktorschaltung modelliert. Hierbei zeigte sich, dass unter Anwendung einer vergleichbaren Reaktionskinetik der Gesamtreaktor als kontinuierlich gerührter Satzreaktor modelliert werden kann. Zur Untersuchung der Stofftransporteinflüsse auf die Reaktion sollte neben der Konzentrationsuntersuchung die Strömungsvorgänge innerhalb der Phasen messtechnisch zugänglich gemacht werden. Aufgrund der begrenzten geometrischen Abmessungen wurde auf die Particle-Imaging-Velocimetry zurückgegriffen. Notwendige Anpassungen an der Versuchsanordnung zur Integration der Messmethode und eine Validierung der Strömungsmessung wurden detailliert beschrieben.
Anschließend an die Entwicklung der Versuchsanordnung wurde am Beispiel der Lipase aus dem Mikroorganismus Thermomyces lanoginosus die Bestimmung der kinetischen Parameter für die Hydrolyse von nativen Rapsöl mithilfe eines Michaelis-Menten-Ansatzes mit kompetitiver Produkthemmung durchgeführt. Die Ermittlung des Reaktionsfortschritts erfolgte durch Messung der Konzentration der freien Fettsäuren in der Ölphase durch nicht wässrige Titration. Zur Berechnung der kinetischen Parameter wurde sowohl die Differentialmethode als auch die Integralmethode angewendet. Parallel wurden die gewonnenen Daten mit den beobachteten Strömungsprofilen der PIV-Messung kombiniert und ein möglicher Einfluss der Schubspannung in Grenzflächennähe als maßgeblicher Faktor für die effektive Reaktionsgeschwindigkeit diskutiert. Des Weiteren konnte eine bereits durch die Literatur beschriebene Abhängigkeit zwischen dem Strömungszustand im Reaktionssystem und der Reaktionsgeschwindigkeit bestätigt werden. Als Ergebnis der Untersuchung wurde für die untersuchte Lipase unter Anwendung von nativen Rapsöl als Substrat eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit von 2,1 mmol/m^2min und eine Inhibierungskonstante für das Produkt von 6,88 mol/m^3 ermittelt.