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The role of AJB35136 and fdtA genes in biofilm formation by avian pathogenic Escherichia coli
(2023)
Background Infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC) result in significant economic losses in poultry industry. APEC strains are known to form biofilms in various conditions allowing them to thrive even under harsh and nutrient-deficient conditions on different surfaces, and this ability enables them to evade chemical and biological eradication methods. Despite knowing the whole genome sequences of various APEC isolates, little has been reported regarding their biofilm-associated genes. A random transposon mutant library of the wild-type APEC IMT 5155 comprising 1,300 mutants was analyzed for biofilm formation under nutrient deprived conditions using Videoscan technology coupled with fluorescence microscopy. Seven transposon mutants were found to have reproducibly and significantly altered biofilm formation and their mutated genes were identified by arbitrary PCR and DNA sequencing. The intact genes were acquired from the wild-type strain, cloned in pACYC177 plasmid and transformed into the respective altered biofilm forming transposon mutants, and the biofilm formation was checked in comparison to the wild type and mutant strains under the same conditions.
Results In this study, we report seven genes i.e., nhaA, fdeC, yjhB, lysU, ecpR, AJB35136 and fdtA of APEC with significant contribution to biofilm formation. Reintroduction of AJB35136 and fdtA, reversed the altered phenotype proving that a significant role being played by these two O-antigen related genes in APEC biofilm formation. Presence of these seven genes across nonpathogenic E. coli and APEC genomes was also analyzed showing that they are more prevalent in the latter.
Biofilme sind Zusammenschlüsse von Mikroorganismen, die eingebettet in einer selbstproduzierten Matrix vor äußeren Umwelteinflüssen geschützt sind und eine erhöhte Toleranz gegenüber Antiinfektiva aufweisen. Im Bereich der Humanmedizin werden 65-80 % aller bakteriellen Infektionen mit Biofilmen assoziiert. Problematisch ist die fehlende Biofilmanalytik in der Routinediagnostik, die auch von der Europäischen Gesellschaft für klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten gefordert wird. So fehlen standardisierte Methoden für den mikroskopischen Nachweis einer Biofilm-assoziierten Infektion, die in situ Quantifizierung von Bakterien auf Implantaten und die Prüfung der Antibiotikaempfindlichkeit von Bakterien in Biofilmen. Mit den in dieser Arbeit etablierten Methoden wurden diese verschiedenen Schwerpunkte im Bereich der bakteriellen Biofilmanalytik beleuchtet. Basierend auf der an der Hochschule Lausitz entwickelten VideoScan-Technologie wurden fluoreszenzmikroskopische Methoden für die Untersuchung von Biofilmen entwickelt. Es wurde ein Modul geschaffen, welches qualitative und quantitative Aussagen über die allgemeine Fähigkeit von Bakterien zur Biofilmbildung treffen kann. Mit Anwendung dieser Methode konnte der Zusammenhang zwischen den genotypischen und phänotypischen Merkmalen von 187 klinischen E. coli-Isolaten und deren Biofilmbildung untersucht werden. Ein weiteres Modul erlaubte die Untersuchung der mit E. coli besiedelten Materialien Glas, Stahl und Titan. Insgesamt 44 Materialstücke (Coupons) wurden auf die Anzahl adhärenter Bakterien, die besiedelte Fläche und die maximal gebildete Biofilmdicke untersucht. Das dritte und letzte Modul fand Anwendung in der Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von S. aureus während der Biofilmbildung und unterschiedlich reifer S. aureus-Biofilme. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die etablierte Methode eine umfangreiche Analyse von Biofilmen für verschiedene Fragestellungen ermöglicht.
In der kommunalen Abwasserreinigung werden unter anderem Biofilmverfahren mit frei beweglichen Aufwuchskörpern mit einer Dichte von ca. 1 kg/m³ (Schwebebett) eingesetzt. Der Betrieb des Biofilmreaktors entspricht einem Mischreaktor. Gegenstand der Arbeit ist, einen Beitrag zur weiteren Aufklärung des komplexen Zusammenhanges von Bemessungsdaten und den Zustandsgrößen des Biofilmverfahrens mit frei beweglichen Aufwuchskörpern zu leisten.
Es erfolgen verfahrenstechnische Betrachtungen von Aufwuchskörpern unterschiedlicher Geometrien zur Durchmischung innerhalb kurzer Zeit im Reaktor und des dazu erforderlichen energetischen Aufwandes. Des Weiteren wird der optimale Füllgrad von Aufwuchskörpern in Abhängigkeit von der Reaktorgestaltung bestimmt.
Unter definierten Laborbedingungen konnten Erkenntnisse hinsichtlich des Temperatureinflusses sowie der BSB5 - Oberflächenbelastung auf die Abbauleistung gewonnen werden. In halbtechnischen Versuchen auf den Kläranlagen Kaditz und Rochlitz fanden Untersuchungen zum Einfahrverhalten unterschiedlicher Aufwuchskörper zu Biomassebildung und zu Abbauleistung statt. Auf der Kläranlage Lunzenau wurde eine im technischen Maßstab nachempfundene Kleinkläranlage im Hinblick auf den Einfluss der organischen Belastung auf die Biomassebildung und Abbauleistung betrieben. Die Bewertung der beschriebenen Versuchsanlagen sowie im Betrieb befindlicher Kleinkläranlagen erfolgt bezüglich der Abwasserkenngrößen, wie Schlammbelastung, Überschussschlammbildung, Schlammalter und Wachstumsraten.
Die Messung von Schichtdicken sowie die Erstellung von Sauerstoffprofilen ermöglicht es, Aussagen zur Effektivität des Stofftransportes im Biofilm zu treffen. Von Interesse sind Aussagen zur Aktivität der Mikroorganismen im Biofilm, welche durch Bestimmung von Enzymaktivitäten (Esteraseaktivität) ermittelt werden konnten. Die simultan ablaufenden Prozesse des Kohlenstoffabbaus, der Nitrifikation und der Denitrifikation durch den Biofilm werden hinsichtlich ihrer Potenziale, Leistungsfähigkeit und Grenzen untersucht, ebenso wie die Elimination von Phosphor.
Auf Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse können theoretische Berechnungen zum Sauerstoffbedarf und zur Sauerstoffzufuhr hergeleitet werden. Insbesondere Kleinkläranlagen und kleine Kläranlagen werden durch den Eintrag von Antibiotika und Desinfektionsmitteln aus Haushalten und Kleingewerbe nachhaltig im Betriebsablauf gestört. Dazu konnten in Laborversuchen Aussagen zu Grenzkonzentrationen ermittelt werden.
Die Anwendung anaerober Biofilme zur Umsetzung organischer Substrate zu Biogas bietet viele Vorteile. Durch die Immobilisierung methanogener Archaeen im System können kurze Verweilzeiten unter hohen Raumbeladungen in sogenannten Hochleistungsfestbettreaktoren ermöglicht werden. Mittlerweile finden sie recht erfolgreich im Rahmen verschiedener, meist zweistufiger Verfahren, eine Anwendung in der Praxis. Das Prinzip eines Rieselbettreaktors als Methanstufe ist bislang unbekannt. Es konnte gezeigt werden, dass sich der vorgeschlagene und patentierte Aufbau eines Rieselbettreaktors im Rahmen eines zweistufigen Verfahrens zur Methanisierung flüssiger und gasförmiger organischer Substrate eignet. Der direkte Vergleich zwischen einem klassischen überstauten Festbettreaktor und dem Rieselbettreaktor zeigte, dass sich beide Prinzipien für die Umsetzung von Essigsäure aber auch von Praxissubstraten (Maishydrolysat) eignet. Die pH-Werte im Ablauf lagen über 7,0, die Methankonzentration im Biogas ist jeweils über 70 Vol%. Bis zu den hohen Raumbeladungen von bR=10-12 kgCSB/(m³FB•d) wurde der theoretische Wert der spezifischen Methanproduktion von P=3-4 Nm³CH4/(m³FB•d) erreicht. Im eingefahrenen und kontinuierlichen Betrieb lag der Methanertrag YoTR,∑ im Rieselbettreaktor zwischen 231-275 NlCH4/kgoTR und im überstauten Festbettreaktor zwischen 246-270 NlCH4/kgoTR. Dem theoretischen Wert von 293 NlCH4/kgoTR wird nahe gekommen. Beide Systeme sind daher sehr gut vergleichbar. Die Zugabe und die Unterbrechung des Substrates die Steuerung der Methanbildung mit einer Reaktionszeit von 3,4-5 Stunden. Der Rieselbettreaktor zeigte ein schnelleres Ansprechverhalten der Methanbildung nach erneuter Substratzugabe aufgrund der Rezirkulation durch das gesamte Festbett. In Hinblick auf den Flexibilitätsbonus im Rahmen der aktuellen Novelle des EEG 2012 wird das Kriterium der Reaktion auf den stündlichen Energiebedarf erfüllt. Im Rieselbettreaktor konnte die Abhängigkeit des Stoffumsatzes von der Raumbeladung bR, der Rezirkulation RV, der Rieselzeit Rt, dem Prozesswasservolumen Vfl bzw. der hydraulischen Verweilzeit Ʈfl nachgewiesen werden. Ʈfl ist dabei entkoppelt von der Kontaktzeit am Biofilm, dem Ort des Stoffumsatzes. In Hinblick auf einen hohen CSB Abbau konnte insbesondere der direkte Zusammenhang zur Rezirkulation ermittelt werden. Zudem zeigte die differenzierte Betrachtung des Rieselverhaltens, dass aufgrund der Ausbildung eines dünneren Rieselfilmes bei einer geringen Rieselzahl R ein höherer Stofftransport in den Biofilm und letztlich ein höherer CSB-Abbau pro Verrieselung stattfand. Der maximale absolute CSB Abbau lag bei einer Raumbeladung von bR=19 m³/(m³FB•d). Diese Abhängigkeiten wurden durch die Kontaktzeit Ct des Substrates mit dem Biofilm zusammengefasst, sodass das ƞCSB-Ct-bR Diagramm dargestellt werden konnte. Mit Hilfe von Ct wurde ein Modell erstellt, wobei die Umsatzrate k und der Korrekturfaktor k* empirisch ermittelt wurden. Als gasförmige Substrate wurden erfolgreich Wasserstoff und Kohlenstoffdioxid methanisiert. Unter Kreislaufführung des Gasstromes im batch-Betrieb erfolgte ein bis zu 98 %-iger Wasserstoffumsatz. Der Methangehalt betrug maximal 97,7 %. Die Raumbeladung lag maximal bei bR=4,43 Nm³H2/(m³FB•d), wobei eine spezifische Methanproduktivität von 1,17 Nm³CH4/(m³FB•d) erreicht wurde. Im Ausblick führt der kontinuierliche Betrieb zu einem vollständigen Umsatz bei einer 100%igen Methankonzentration. Damit konnte erstmals Wasserstoff (beispielsweise elektrolytisch erzeugt) und Kohlenstoffdioxid unter moderaten Temperatur- und Druckbedingungen methanisiert werden. Es liegt ein Energieträger vor, der sehr gut in klassischen Speichern (Erdgasnetz) ohne aufwendige Aufreinigung eingespeist werden kann. Die Inbetriebnahme und der Betrieb sowohl des überstauten Festbettreaktors als auch des Rieselbettreaktors ermöglichte die Beobachtung der Biofilmentwicklung. Dabei wurde eine vergleichbare Biofilmausbildung festgestellt. Im Rieselbettreaktor erfolgte ein erhöhter Biomasserückhalt, vermutlich aufgrund einer ungleichen Strömungsverteilung. Nach 239 Versuchstagen konnte ein vergleichbarer Biomasseanteil für beide Reaktorprinzipien von 14 gFM/FK (35 goTR/m²FKAO) bei einer mittleren Biofilmdicke von 600 µm bestimmt werden. Der Biomasseertrag YoTR/CSB entspricht mit 0,016-0,020 goTR/gCSB in beiden Reaktoren den Literaturwerten von 0,01-0,06 goTR/gCSB. Unter Betrachtung der Strömungsverhältnisse der Flüssigkeitsschicht am Biofilm, der Konzentrationsgrenzschicht, des Stoffüberganges und des Stoffabbaus konnte eine Umsatzlimitierung festgestellt werden. Im Rieselbettreaktor lag eine Reaktionslimitierung bis zu einer mittleren Biofilmdicke von 174 µm vor. Bei einer höheren Biofilmdicke erfolgte eine Diffusionslimitierung. Die Bestimmung der methanogenen Archaeen im Rieselbettreaktor zeigte, dass sowohl beim flüssigen als auch gasförmigen Substrat der hydrogenotrophe und der acetoklastische Stoffwechsel parallel erfolgte.