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Lipasen sind esterolytische Enzyme, welche vorzugsweise an Lipid/Wasser Phasengrenzen aktiv sind. Von großer Bedeutung sind diese Biokatalysatoren bei etablierten industriellen Prozessen, wie z.B. in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie sowie der Herstellung von Detergenzien oder als Additiv in Waschmitteln. Neue Anwendungsgebiete, wie die Produktion von Feinchemikalien für die Pharma- und Agrarindustrie sowie die Herstellung von Biodiesel stellen Herausforderungen dar. Gerade in den letztgenannten Industriezweigen werden herkömmlichen chemischen Verfahren bevorzugt, da die Herstellungskosten von Enzymen einen großtechnischen Einsatz behindern. Um die Kosten für den Einsatz des Biokatalysators zu minimieren, wurden drei Ansatzpunkte bearbeitet.
Bei der Produktion von Lipasen oder anderen Enzymen durch Mikroorganismen fallen Investitions- und Betriebskosten an. Investitionskosten werden maßgeblich vom Reaktordesign und dessen Größe bestimmt, wobei die Betriebskosten zum Beispiel durch den hohen Einsatz von Energie und Zeit bei der Sterilisation sowie teuren Medienbestandteilen festgesetzt werden. Aus dieser Betrachtung heraus wurde in vorhergehenden Arbeiten ein selektives Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik entwickelt, bei dem die Kosten für die Sterilisation entfallen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Maßstabsvergrößerung auf ein Volumen von 350 l durchgeführt. Die robuste Selektivität des Kultivierungssystems im 100-l- und 350-l-Maßstab wurde in 13 individuellen Läufen über einen Kultivierungszeitraum von acht bis zwölf Tagen mit dem Kompostisolat Phialemonium curvatum AW02 gezeigt. Der Mikroorganismus P. curvatum AW02 sowie dessen extrazelluläre Lipasen wurden partiell charakterisiert. Es zeigte sich, dass P. curvatum AW02 mindestens eine zellwandgebundenen Lipase sekretiert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das selektive Kultivierungsverfahren mit minimierter Steriltechnik das alleinige Wachstum weiterer bekannter Mikroorganismen, wie z.B. Aspergillus niger, Botrytis cinerea oder Yarrowia lipolytica begünstigt.
Der zweite Ansatzpunkt zur Kostenminimierung ist die Wiederverwendung sowie Stabilisierung des Enzyms durch Immobilisierung, was intensive Entwicklungsarbeit voraussetzt. So wurde ein in der Handhabung leicht durchführbares Immobilisierungsverfahren entwickelt, das auf der Einbettung wasserfreier Enzympräparate in ein Polymer-Harz basiert. Dieses Enzym-Polymerharz-Gemisch kann auf Oberflächen mit unterschiedlichen physikalischen oder chemischen Eigenschaften aufgebracht werden. Als Modellenzym wurde die robuste, Co-Faktor unabhängige, monomere Thermomyces lanuginosus Lipase (TLL) genutzt. Die Immobilisierung mittels wasserfreiem Einbettungsverfahren konnte erfolgreich mit Aktivitäten von bis zu 250 mU/cm² beschichteter Oberfläche gegenüber p- Nitrophenyl-Palmitat (pNPPalm) nachgewiesen werden. Die Co-Faktor-abhängige und unter nativen Bedingungen als Homotetramer vorliegende Threonin Aldolase aus Ashbya gossypii wurde als zweites Beispielenzym erfolgreich mit dem wasserfreien Einbettungsverfahren immobilisiert. Somit konnte gezeigt werden, dass das neuartige wasserfreie Einbettungsverfahren auf verschiedene Enzyme mit unterschiedlicher Komplexität anwendbar ist.
Der dritte Ansatzpunkt ist die Entwicklung eines quantitativen Mikrotiter-Lipase-Nachweissystems. Verschiedene labor- und zeitintensive Verfahren weisen lipolytische Aktivität nach. Um ein schnelles und einfaches Lipase-Nachweissystem zu etablieren, wurde ein turbidimetrisches Lipase-Nachweissystem im Mikroliter-Maßstab, basierend auf einer stabilisierten 1 % (v/v) Tributyrinemulsion entwickelt. Durch die Hydrolyse des Tributyrins kommt es zu einer kontinuierlichen Klärung. Das Auftragen variabler Mengen des Modellenzyms TLL zeigte eine direkte Abhängigkeit zwischen Lipasekonzentration und Abnahme der Extinktion bei 595 nm. Eine eingehende Charakterisierung ergab, dass ein Substratüberschuss bei 1 % (v/v) Tributyrin vorliegt. Somit kann das turbidimetrische Mikrotiter-Lipase-Nachweissystem zur Quantifizierung lipolytischer Proben eingesetzt werden.
Jeder der drei Ansatzpunkte trägt das Potential, robust und einfach, unter kostenminimierten Bedingungen Enzyme herzustellen, sie zu immobilisieren sowie lipolytische Aktivität zu quantifizieren. Daraus ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten aber auch interessante wissenschaftliche Perspektiven.
Mit zunehmender Knappheit an Energieressourcen und den daraus resultierenden hohen Energiekosten entwickelt sich ein Bedarf, energieintensive Verfahren der produzierenden Industrie durch Verfahren geringeren Energiebedarfs und höherer Produktselektivität zu ersetzen. In der stoffumwandelnden Industrie kommen als Substitutionsverfahren biokatalytische Prozesse in Frage. Als Voraussetzung für eine kommerzielle Anwendung von Enzymprozessen ist ein quantitatives und qualitatives Verständnis der grundlegenden physikalischen und chemischen Phänomene, die diesen Prozessen obliegen, notwendig. Die Hydrolyse von Ölen und Fetten ist ein Beispiel, bei dem die Produkte neben dem technisch etablierten Verfahren alternativ biokatalytisch herstellbar sind. Zur Reaktorauslegung sowie für eine optimale Prozessführung ist die Kenntnis der Reaktionskinetik notwendig. Die Kinetik dieser heterogenen Reaktion wird maßgeblich durch Qualität und Quantität der Phasengrenzfläche sowie dem Enzymverhalten (Aktivität, Stabilität) während der Reaktion bestimmt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der phänomenologischen Beschreibung der Reaktionskinetik auf der Basis von kinetischen Untersuchungen für die biokatalytische Hydrolyse von Rapsöl in einer w/o-Emulsion (25 Vol.-% wässrige Phase). Dabei galt es, den Reaktionsfortschritt (Fourier-Transformations-Infrarot(FTIR)-Absorptionsspektroskopie) und die Phasengrenzfläche (Photonendichtewellen(PDW)-Spektroskopie) in hoher zeitlicher Auflösung zu messen sowie Einflüsse wie Temperatur, pH-Wert, Substratverhältnis und Rührergeschwindigkeit auf das Enzymverhalten zu bestimmen. Mit dem Ziel, eine wirtschaftliche Lipasekonzentration abschätzen zu können, wurden zudem Kenntnisse bezüglich des Lipase- und Fettsäureverhaltens an der Grenzfläche mittels der Pendant-Drop-Methode während der Reaktion gewonnen.