TY - THES A1 - Liedtke, Victoria T1 - Elucidating the role of DFS70/LEDGF/p75 in DNA damage response using CRISPR/Cas9 technology T1 - Aufklärung der Rolle von DFS70/LEDGF/p75 bei der DNA-Schadensantwort mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie N2 - Lens epithelium derived growth factor (LEDGF), is known to be overexpressed in different solid cancers and cancer cell lines but is also involved in acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and diverse inflammatory diseases. Due to its chromatin-binding ability, it acts as a transcriptional coactivator, promoting anti-apoptotic pathways leading to increased tumor aggressiveness and chemotherapy resistance. In this thesis, the role of LEDGF in laryngeal cancer cells was investigated. Thus, a knock-out of LEDGF in HEp-2 cells was successfully generated by CRISPR/Cas9 technology. Moreover, LEDGF-deficient HEp-2 cells exhibited a decreased proliferation and migration, as well as an increased chemotherapy sensitivity towards topoisomerase II inhibitor etoposide. The DNA damage response was in more detail investigated, where LEDGF depleted cells showed a drastic reduction in the recruitment of downstream damage-response related proteins, more precisely replication protein A subunit of 32kDa (RPA32), and an increased amount of DNA fragmentation, highlighting the role of LEDGF in homology-directed DNA repair. In addition, a efficient method was established to allow genomic tagging of LEDGF at its C-terminus with EGFP which enables the monitoring of LEDGF in living cells. Therefore, an efficient Cas9-mediated DNA DSB induction was supplemented with a DNA template containing homology arms to the C-terminus as well as the EGFP sequence to allow homology-directed repair. Subsequently, EGFP-expressing cells were FACS sorted and single cells expanded. Almost all test clones showed a homozygous genotype for LEDGF-EGFP fusion which exhibited the typical nuclear pattern of LEDGF. N2 - Der von Linsenepithel abgeleitete Wachstumsfaktor (LEDGF) ist dafür bekannt, dass er in verschiedenen Krebsarten und Krebszelllinien überexprimiert ist, aber auch am erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS) und verschiedenen entzündlichen Erkrankungen beteiligt ist. Aufgrund seiner chromatin-bindenden Wirkung agiert er als transkriptioneller Coaktivator, der anti-apoptotische Wege fördert, welche wiederum zu erhöhter Tumoraggressivität und Chemotherapie-Resistenz führen. In dieser Arbeit wurde die Rolle von LEDGF in Kehlkopfkrebszellen untersucht. Mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie wurde LEDGF in HEp-2 Zellen erfolgreich ausgeschalten. Darüber hinaus zeigten LEDGF K.O. HEp-2-Zellen eine verminderte Proliferation und Migration sowie eine erhöhte Chemotherapie-Sensitivität gegenüber dem Topoisomerase-II-Inhibitor Etoposid. Bei der Untersuchung der DNA-Schadenreaktion zeigten LEDGF K.O. Zellen eine signifikante Verringerung der Rekrutierung von Downstream-Proteinen, hier im speziellen von der Replikationsprotein A 32kDa-Untereinheit (RPA32), und eine erhöhte Menge an DNA-Fragmentierung, was die Rolle von LEDGF bei der Homologie-spezifischen DNA-Reparatur unterstreicht. Darüber hinaus wurde eine effektive Methode etabliert, um den C-Terminus von LEDGF genomisch mittels EGFP zu markieren, um so die Beobachtung von LEDGF in lebenden Zellen zu ermöglichen. Hierbei wurde ein effizienter Cas9-induzierter DNA-Doppelstrangbruch herbeigeführt und durch eine DNA-Vorlage ergänzt. Diese enthält homologe Bereiche zum LEDGF C-Terminus sowie die EGFP-Sequenz, um eine Homologie-spezifische Reparatur zu ermöglichen. Anschließend wurden EGFP-exprimierende Zellen mittels FACS sortiert und Einzelzell-Kolonien gebildet. Fast alle Testklone zeigten einen homozygoten Genotyp für das LEDGF-EGFP-Fusionsprotein, mit dem typischen nukleären Expressionsmuster von LEDGF. KW - LEDGF KW - Wachstumsfaktor KW - Linsenepithel KW - Kehlkopfkrebs KW - CRISPR/Cas-Methode KW - CRISPR/Cas9 KW - Etoposide KW - DNA-Schadensantwort KW - FACS KW - CRISPR/Cas9 KW - LEDGF KW - Etoposide KW - DNA damage response KW - FACS Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-55913 ER -