TY - THES A1 - Schmidt, Jonas Paul Christian T1 - Nanopore sequencing in laboratory medicine : novel molecular diagnostic prospects for Familial Mediterranean fever and SARS-CoV-2 infections T1 - Nanopore-Sequenzierung in der Labormedizin : neue molekulardiagnostische Ansätze für Familiäres Mittelmeerfieber und SARS-CoV-2 Infektionen N2 - Nanopore sequencing, a third-generation sequencing technique that applies nanometre sized pores to transduce the physical and chemical properties of specific nucleobases into measurable electrical signals, shows attractive advantages over conventional next-generation sequencing techniques. However, primarily due to high sequencing error rates this technique has rarely been used so far in clinical laboratory diagnostics. In this cumulative dissertation Nanopore sequencing was established and validated in clinical diagnostics using the example of the molecular diagnosis of Familial Mediterranean fever (FMF) and SARS coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infections. First, a novel data analysis pipeline for accurate single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping using Nanopore sequencing data was developed and validated with the corresponding sequencing protocol against conventional Sanger sequencing using 47 samples of patients with clinical suspicion of FMF. This method comparison showed a perfect agreement between both methods rendering current Nanopore sequencing in principle suitable for SNP genotyping in human genetics. The bioinformatic analysis of sequencing data is one of the most challenging parts in Nanopore sequencing experiments and complicates the application in a clinical diagnostic setting. Therefore, six different bioinformatic tools for sequence alignment were evaluated regarding their applicability to Nanopore sequencing data. This evaluation revealed a good suitability of all except one of these tools although differences in quality and performance exist. Since Nanopore sequencing showed a robust performance in SNP genotyping, a SARS-CoV-2 whole genome sequencing (WGS) protocol was established to enable onside viral WGS in a clinical laboratory. This was especially important for viral molecular biological surveillance during the pandemic as shown by analysing viral genetic data over the course of one year. Applying this approach in a clinical research project to investigate host-virus interaction by aggregating for the first time viral genetic data, serological data and clinical data, showed diverse humoral immune responses to SARS-CoV-2, that appear to be influenced by age, obesity and disease severity. Further, even small viral genetic changes may influence the clinical presentation of the associated disease COVID-19. Additionally, a novel reverse transcriptase (RT)- loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of SARS-CoV-2 was developed and validated for diagnostic use by method comparison with conventional RT-polymerase chain reaction (PCR). In summary, by presenting advancements of sequencing and bioinformatic workflows with the focus on an application in clinical diagnostics, the results of this thesis may pave the way for a broader application of Nanopore sequencing in laboratory medicine in the near future. N2 - Die Nanopore-Sequenzierung, eine Nukleinsäure-Sequenziertechnologie, bei der Poren im Nanometerbereich verwendet werden, um die molekularen Eigenschaften einzelner Nukleobasen in elektrisch messbare Signale umzuwandeln, weist einige Vorteile im Vergleich zu Next-Generation Sequenzierverfahren auf. Im Wesentlichen aufgrund einer hohen Fehlerrate wird die Technik bisher kaum in der klinischen Diagnostik verwendet. In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurde die Nanopore-Sequenzierung am Beispiel der molekularen Diagnostik von familiärem Mittelmeerfieber (FMF) und SARS Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) Infektionen für die klinische Diagnostik etabliert und validiert. Hierzu wurde zunächst eine neue Datenanalyse Pipeline für die zuverlässige Bestimmung von Einzelbasenaustauschen (SNPs) entwickelt und mit dem dazugehörigen Sequenzierprotokoll durch einen Methodenvergleich mit konventioneller Sanger-Sequenzierung unter Verwendung von 47 klinischen Proben von FMF-Patienten validiert. Dabei konnte eine perfekte Übereinstimmung zwischen beiden Methoden gezeigt werden, was die Anwendbarkeit der Technologie für SNP-Genotypisierung demonstriert. Die bioinformatische Auswertung der Daten stellt eine wesentliche Herausforderung bei der Durchführung von Nanopore-Sequenzierexperimenten dar und erschwert damit eine diagnostische Anwendung. Um dies zukünftig zu vereinfachen, wurden sechs verschiedene Sequenz-Alignment Programme hinsichtlich Ihrer Anwendbarkeit auf Nanopore-Sequenzierdaten überprüft. Dabei konnte gezeigt werden, dass trotz deutlicher Unterschiede in Qualität und Leistungsfähigkeit alle bis auf eines dieser Programme für die Analyse entsprechender Datensätze verwendet werden können. Da sich die Nanopore-Sequenzierung als gut geeignet für SNP-Genotypisierung erwies, wurde zusätzlich ein SARS-CoV-2 Vollgenom-Sequenzierprotokoll etabliert, um die Vollgenom-Sequenzierung im Diagnostiklabor zu ermöglichen. Dies hat sich insbesondere als wichtig für die molekularbiologische Surveillance im Rahmen der Pandemie erwiesen. Zusätzlich wurde das Vollgenom-Sequenzierprotokoll in einem klinischen Forschungsprojekt verwendet, um Wirt-Virus Interaktionen zu untersuchen, indem zum ersten Mal virale genetische Daten, serologische Daten und klinische Daten aggregiert ausgewertet wurden. Dabei konnte eine breit gefächerte humorale Immunantwort auf das Virus beobachtet werden, die im Wesentlichen von den Faktoren Alter, Übergewicht und dem Schweregrad der Erkrankung beeinflusst wurde. Außerdem konnte dargestellt werden, dass vermutlich schon kleine Veränderungen im viralen Genom das klinische Bild der assoziierten Erkrankung COVID-19 beeinflussen. Abschließend wurde im Rahmen der Dissertation eine neue reverse Transkriptase (RT)- Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Methode zum Nachweis von SARS-CoV-2 entwickelt und für die diagnostische Anwendung durch einen umfassenden Methodenvergleich mit konventioneller RT-Polymerasekettenreaktion (PCR) validiert. KW - Nanopore sequencing KW - Laboratory medicine KW - Molecular diagnostics KW - Familial Mediterranean fever KW - SARS-CoV-2 KW - Nanopore-Sequenzierung KW - Labormedizin KW - Molekulare Diagnostik KW - Familiäres Mittelmeerfieber KW - Familiäres Mittelmeerfieber KW - Labormedizin KW - Molekulare Diagnostik KW - Sequenzierung KW - SARS-CoV-2 KW - Diagnostics KW - Molecular medicine Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-63847 ER - TY - THES A1 - Sowa, Mandy T1 - Entwicklung und Evaluierung einer Multiparametertechnologie zur serologischen Diagnostik von Autoimmunerkrankungen T1 - Development and evaluation of a multiparametric technology for the serological diagnostic of autoimmune diseases N2 - Die Zunahme der Komplexität diagnostischer Fragestellungen veranlasst die Entwicklung von innovativen Teststrategien. Multiparameterteste sind eine Antwort auf die sich im Wandel befindende Routinediagnostik von Autoimmunerkrankungen. In der vorliegenden kumulativen Dissertation wurde eine neue multiparametrische Technologie für den Bereich der Autoimmundiagnostik entwickelt und klinisch evaluiert. Diese CytoBead Technologie ist eine Kombination aus Screeningtest, definiert durch die indirekte Immunfluoreszenz als diagnostischen Goldstandard, und einen multiplexen Bestätigungstest, welcher durch einen Mikropartikel-basierten Immunfluoreszenztest umgesetzt wurde. Zur serologischen Diagnostik von anti-neutrophilen zytoplasmatischen Antikörpern (ANCA) assoziierten Vaskulitiden wurde der CytoBead ANCA entwickelt. Dieser Multiparametertest beinhaltet eine Kombination aus indirekter Immunfluoreszenz mit Ethanol fixierten Granulozyten und Mikropartikel-basiertem Immunfluoreszenztest mit Proteinase 3 und Myeloperoxidase. Wesentliche Vorteile gegenüber den klassischen Testen sind Zeit- und Kosteneinsparungen, die in der Routinediagnostik unerlässlich sind. Unter der Prämisse der deutlichen Zeiteinsparung von mehreren Bearbeitungsstunden oder sogar Tagen wurde diese Technologie für verschiedene, krankheitsspezifische Bereiche als Werkzeug der Profildiagnostik entwickelt. Besonders im Bereich der Notfalldiagnostik von Autoimmunerkrankungen zählt jede Stunde, wenn es um das Überleben der Patienten geht. Die Weiterentwicklung dieser Technologie für die serologische Diagnostik der Rapid Progressiver Glomerulonephritis (RPGN) als Notfalldiagnostik, ist ein wesentlicher Beitrag für eine effiziente in-vitro Diagnostik. Die sich anschließenden klinischen Studien des CytoBead ANCA und CytoBead RPGN wiesen gute bis sehr gute Vergleichbarkeiten zu klassischen Testen auf. Die Studien untermauerten zudem die Wichtigkeit der CytoBead Technologie hinsichtlich Nachhaltigkeit und Patientenmonitoring. Ein wichtiges Hauptaugenmerk der Testentwicklung lag in der Stabilität, Reproduzierbarkeit, Standardisierung und Quantifizierbarkeit von Ergebnissen, die im Rahmen dieser Dissertation evaluiert werden konnten. Für eine weitere CytoBead Entwicklung und Evaluierung im Bereich der autoimmunen Lebererkrankungen konnte im Rahmen dieser Dissertation ein wichtiger Grundstein gelegt werden. Es wurde ein Screeningtest auf Basis der indirekten Immunfluoreszenz mit Glykoprotein 2 (Isoform 1,2,3,4) transduzierten HEp-2 Zellen entwickelt und anschließend in einer klinischen Studie evaluiert. Innerhalb dieser Studie konnte eine mögliche neue, autoantigene Zielstruktur für Patienten mit Primär Sklerodisierende Cholangitis identifiziert werden. Zusammenfassend stellt sich die Entwicklung der CytoBead Technologie als eine neue, innovative Generation der serologischen Diagnostik von Autoimmunerkrankungen dar, welche zusätzlich auf verschiedene Diagnostikprofile angepasst werden kann. N2 - The growing demand within the healthcare system for new innovative diagnostics needs to be addressed by the development of novel, innovative strategies. In case of in-vitro diagnostics for autoimmune disorders, a new era has been ushered in by the development of novel multiparametric assay techniques becoming part of the daily laboratory workflow. In the current cumulative thesis a new multiparametric technology, named CytoBead, was developed and evaluated. It was established to have a highly variable tool for profiled serological diagnostics of autoimmune disorders. The CytoBead combines an indirect immunofluorescence screening method with a microbead immunoassay as confirmatory assay. For the serological diagnostics of anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated vasculitis, the CytoBead ANCA assay combining ANCA testing with anti-proteinase 3 and anti-myeloperoxidase antibody microbead immunoassays was developed and subsequently evaluated within a clinical study. The main advantages of the new CytoBead assay in contrast to the classical assays are the time and cost efficiency. Especially, in an autoimmune emergency case like the rapidly progressive glomerulonephritis (RPGN), fast and reliable diagnostic results are essential for the survival and the well-being of the patients. According to the required profile diagnostics of this disease, the CytoBead RPGN was developed. Thus, the assay contains ethanol fixed granulocytes as well as microbeads coated with proteinase 3, myeloperoxidase, doubled-stranded desoxy ribonucleic acid and glomerular basement membrane antigen. The clinical studies of the CytoBead ANCA and RPGN assay showed good to very good agreement with classical assays and provided important information regarding the assay characteristics, stability, standardization and performance. Using novel digital image processing software and the AKLIDES® system, a fully quantitative analysis of all results was obtained. Another key aspect in the current work was the development and evaluation of a new indirect immunofluorescence assay for the serological diagnosis of primary sclerosing cholangitis by analysis of anti-Glycoprotein 2 autoantibodies. The assay was based on Glycoprotein 2 isoform-transduced HEp-2 cells. In the corresponding clinical study, a significant association of anti-Glycoprotein 2 (isoform 1,2,3,4,) IgA with primary sclerosing cholangitis was revealed. Consequently, a potentially novel autoantigenic target was found for primary sclerosing cholangitis. Furthermore, a correlation of anti-Glycoprotein 2 IgA with the clinical phenotype in primary sclerosing cholangitis was determined, which could indicate a possible pathogenetic role of these autoantibodies. This screening assay was the basis for the development of a new CytoBead assay for the serological diagnosis of autoimmune liver diseases. Summarizing the development of the novel CytoBead technology, this multiparametric assay is a new generation for autoantibody detection and applicable for different diagnostic profiles. KW - CytoBead KW - Multiparametertechnologie KW - Autoimmunerkrankungen KW - Serologische Diagnostik KW - Autoantikörper KW - CytoBead KW - Autoimmune diseases KW - Multiparametric assay KW - Autoantibodies KW - Microbeads KW - Multiparameteranalyse KW - Autoantikörper KW - Serodiagnostik KW - Autoaggressionskrankheit Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-51514 ER - TY - THES A1 - Liedtke, Victoria T1 - Lens epithelium-derived growth factor (LEDGF) as an aid in the diagnosis of benign prostatic hyperplasia (BPH) and the molecular principles of LEDGF in human cancer cells T1 - Vom Linsenepithel abgeleiteter Wachstumsfaktor (LEDGF) als Hilfsmittel für die Diagnose der gutartigen Prostatahyperplasie (BPH) und die molekularen Grundlagen von LEDGF in menschlichen Krebszellen N2 - Benign prostatic hyperplasia (BPH) is considered an age-related disease of men with unknown etiopathophysiology. Chronic inflammation represents one of the most important pathophysiological mechanisms in this context, and there is also evidence for the involvement of autoimmune responses in an inflammatory environment in the prostate. Conventional therapeutic approaches for BPH are limited; however, immunosuppression by TNF (tumor necrosis factor)-𝛼 blockers seems to reduce symptoms in BPH patients due to the reduction of epithelial hyperplasia and macrophage-triggered inflammation. Therefore, this cumulative dissertation addresses biomarker-based BPH diagnosis by lens epithelium-derived growth factor splice variant 75 kDa (LEDGF/p75). LEDGF/p75 is an autoantigen that is overexpressed in solid tumors and functions as a stress-related transcriptional co-activator. It also plays an important role in cancer and DNA damage repair (DDR). The generation of CRISPR/Cas9-modified HEp-2 LEDGF deficient (KO) and HEp-2 LEDGF/p75 overexpressing (OE) cell lines provided new insights for the diagnosis and therapy of cancer and genetic disorders. Herein, IgG autoantibody reactivity to LEDGF/p75 was detected in patients with prostate cancer (PCa, n=89), bladder cancer (BCa, n=116), benign prostatic hyperplasia (BPH, n=103) and blood donors (BD, n=60) by indirect immunofluorescence assay (IFA) linear immunoassay (LIA) and Chritidia luciliae immunofluorescence test (CLIFT). In addition, proliferation and migration capacity as well as chemosensitivity of genome-edited cells were determined by optimized all-in-one approach, followed by investigation of DDR signaling pathways by Western blot and immunofluorescence. Surprisingly, no increased binding of autoantibodies (autoAbs) to LEDGF/p75 was detected in cancer patients, but autoAb reactivity to LEDGF/p75 O/E cells was unexpectedly increased in approximately 50% of patients with BPH. At the molecular level, LEDGF-deficient cells exhibit decreased proliferation and migration and increased sensitivity to the chemotherapeutic agent etoposide. A significantly Decreased DNA damage response could also be visualized. New diagnostic capabilities using HEp-2 cells overexpressing LEDGF/p75 or mitochondrial DNA as autoimmune targets could be used to identify BPH patients with autoimmune responses. Furthermore, this Thesis shows that LEDGF is not only involved in the recruitment of DNA damage response proteins, but also affects the proteosomal regulation of DDR signaling molecules. N2 - Die benigne Prostatahyperplasie (BPH) gilt als altersbedingte Erkrankung des Mannes mit unbekannter Etiopathophysiology. Chronische Entzündungen stellen in diesem Zusammenhang eine der wichtigsten pathophysiologischen Mechanismen dar, zudem gibt es Beweise für die Beteiligung von Autoimmunreaktionen in einem entzündlichen Umfeld in der Prostata. Konventionelle Therapiekonzepte für BPH sind begrenzt, eine Immunsuppression durch TNF-𝛼-Blocker scheint jedoch die Symptome bei BPH-Patienten aufgrund der Verringerung der Epithelhyperplasie und der durch Makrophagen ausgelösten Entzündung zu verringern. Die vorliegende kumulative Dissertation befasst sich daher mit der Biomarker-basierten BPH-Diagnostik durch die vom Linsenepithel-abgeleitete Wachstumsfaktor Splicevariante mit 75 kDa (LEDGF/p75). LEDGF/p75 ist ein Autoantigen, das in soliden Tumoren überexprimiert wird und als stressbedingter transkriptioneller Co-Aktivator fungiert. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei Krebs und der DNA-Schadensreparatur. Durch die Erzeugung von CRISPR/Cas9-modifizierten HEp-2 LEDGF defizienten und HEp-2 LEDGF/p75 überexprimierenden Zelllinien konnten neue Erkenntnisse für die Diagnostik und Therapie von Krebs und genetischen Störungen gewonnen werden. Hierfür wurde die IgG-Autoantikörperreaktivität auf LEDGF/p75 bei Patienten mit Prostatakrebs (PCa, n=89), Blasenkrebs (BCa, n=116), benigner Prostatahyperplasie (BPH, n=103) und Blutspendern (BD, n=60) mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IFA) linearem Immunoassay (LIA) und Chritidia luciliae Immunfluoreszenztest (CLIFT) nachgewiesen. Zudem wurde die Proliferations- und Migrationskapazität sowie die Chemosensitivität der genom-editierten Zellen mittels optimiertem All-in-One Ansatz bestimmt, gefolgt von der Untersuchung der DDR-Signalwege durch Western Blot und Immunfluoreszenz. Überraschenderweise konnte bei Krebspatienten keine erhöhte Bindung von Autoantikörpern gegen LEDGF/p75 festgestellt werden, aber die Autoantikörperreaktivität auf LEDGF/p75 O/E-Zellen war bei etwa 50 % der Patienten mit BPH unerwartet erhöht. Auf molekularer Ebene zeigen LEDGF-defiziente Zellen eine verringerte Proliferation und Migration sowie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Chemotherapeutikum Etoposide auf. Auch eine signifikant verringerte DNA-Schadensantwort konnte sichtbar gemacht werden. Neue diagnostische Möglichkeiten unter Verwendung von HEp-2-Zellen mit Überexpression von LEDGF/p75 oder mitochondrialer DNA als Autoimmunziele könnten zur Identifizierung von BPH-Patienten mit Autoimmunreaktionen eingesetzt werden. Darüber hinaus zeigt diese Thesis, dass LEDGF nicht nur an der Rekrutierung von Proteinen der DNA-Schadensantwort beteiligt ist, sondern auch die proteosomale Regulierung von DDR-Signalmolekülen beeinflusst. KW - Y-H2AX KW - LEDGF/p75 KW - CRISPR/Cas9 KW - Prognostic biomarker KW - DNA damage signaling KW - Autoimmunity KW - DNA Reparatur KW - Darmkrebs KW - Autoimmunerkrankungen KW - Autoaggressionskrankheit KW - Prostatahypertrophie KW - Autoantigen KW - DNS-Reparatur Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:kobv:co1-opus4-66988 ER -